奶牛養殖場環境大腸桿菌的ERIC-PCR分型和系統進化分群

何卓琳，唐敏嘉，張雪婧，侯 曉，蒲萬霞

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農業農村部獸用藥物創制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)在環境和動物體內外廣泛存在，可通過飲水、食物以及密切接觸等途徑傳播[1]。糞便是E.coli的“儲存庫”[2]，可向外界散播病原菌，污染飲水、飼草、農作物[3]，也可改變黏膜屏障破壞體內菌群平衡或感染局部組織[4]，最終危害人類和動物健康。養殖場通常添加干燥土壤和秸稈維持運動場的干燥和潔凈，同時也為微生物提供了繁殖場所，對動物健康存在潛在危險。糞便作為有機肥料，用于農作物生產[5]，可增加動植物間的傳播和食物鏈污染的風險[6]。

目前動物感染和動物產品污染致病性E.coli在動物健康和公共衛生安全上是一個嚴重的問題。2019年4月在美國10個州暴發的牛肉污染E.coliO103事件強調了流行病學調查和尋找簡便高效的微生物溯源技術及分型方法的重要性[7]。因此，準確、快速地比較菌株間親緣關系和精細分型，對流行病學調查、控制和預防具有重要意義。本試驗選擇奶牛養殖環境分離E.coli進行親緣關系和系統進化分群分析，以期為健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2017—2019年，在新疆某大型奶牛場(養殖規模2.5萬頭)相對固定位置采集樣品209份，見表1。糞(土)樣用五點混合采樣法采集，在運動場或糞池四周的中點及中心采樣(糞土五個點的樣同樣由五點采樣法所得)，每點均采500 g或500 mL左右，裝入自封袋或滅菌瓶，同一運動場或糞池的樣混勻為1份。采奶樣時，將乳房擦拭消毒，棄去前2把，收集8～10 mL于無菌離心管。水樣則隨機選擇3個使用水的出水口，各采集500 mL。空白土壤和苜蓿地樣品采集同糞(土)。

表1 樣品來源Table 1 Sample source

1.2 主要設備和試劑

PCR儀、凝膠成像儀(美國Applied Biosystems)、電泳儀(北京六一)、移液器和高速離心機(Eppendorf)。細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PremixTaqTM、10×TaqBuffer(Mg2+)、dNTP(2.5 mmol·L-1each)、Taq酶(5 U·μL-1)、DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 引物設計

所需引物[8-9]由北京擎科生物有限公司合成。

1.4 大腸桿菌的分離純化

稱取除奶及水外的樣品100 g或100 mL，加入400 mL滅菌LB液體培養基，混勻，吸上清液5 mL接于100 mL滅菌LB液體培養，37 ℃，160 r·min-1條件下增菌15 h。吸取1 mL奶樣或水樣，加到9 mL LB滅菌液體培養基中，增菌。無菌條件下蘸取增菌液，在麥康凱培養基上接種，37 ℃倒置培養18 h，挑取疑似單菌落2～5個，直至純化；將純化后的菌接于伊紅美藍培養基，37 ℃培養16 h，觀察菌落是否為黑色帶金屬光澤，若是則保留，否則舍棄。

1.5 分離菌株的鑒定、去重及同源性分析

用純化菌株DNA為模板，擴增16S rRNA序列。反應體系25 μL：2×TaqPrimer Mix 12.5 μL，通用上下游引物、DNA模板各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應退火條件為53 ℃ 45 s。擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，拍照記錄。把符合預期大小的產物送上海派森諾生物有限公司測序，將測序結果進行比對，按相似性≥99%判定。對分離E.coli用ERIC-PCR擴增、電泳，來自同一樣品中條帶數目及大小一致的菌株視為重復，僅留1株。用MEGA7.0軟件對保留E.coli序列與參考株16S rRNA基因序列構建遺傳進化樹，進行同源性分析。

1.6 大腸桿菌的ERIC-PCR基因分型

以非重復E.coli的DNA做模板，用Eric引物擴增，體系20 μL：10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶1 μL、ERIC引物各0.5 μL，模板DNA1.5 μL；ddH2O 12 μL。反應退火條件為52 ℃ 1 min。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并拍照記錄，把≥2條帶的菌株用Bio Numerics軟件繪制UPGMA聚類圖，條件位置差異容許度和優化值為1.5%。按相似度≥75%為同一型判定多態性。

1.7 大腸桿菌的系統進化分群

參考Clermont[8]的方法，進行系統發育分群試驗。

2 結 果

2.1 細菌分離鑒定、去重及同源性分析

經增菌、特異性培養基分離純化、16S rRNA PCR檢測、測序、Blast比對及ERIC去重，141份分離出338株E.coli，2017—2019年分別為104、118和116株。分離率為67.46%(141/209)；糞(土)樣品分離率最高，為100%；2017—2019年奶樣分離率分別為46.67%、56.67%和73.33%；2017年空白土壤和苜蓿地樣品分離率為25%，其余樣品未分離出E.coli。經16S rRNA相似性分析，較多糞(土)樣分離菌株與MN208150.1(尿液或環境分離，條件致病性)的相似性達100%。

2.2 ERIC-PCR基因分型

ERIC-PCR分型的條帶數為2～9，大小500～5 000 bp，將E.coli分為Ⅰ～ⅩⅣ共14型。Ⅳ型為優勢型，196株，相似度77.7%～100%，29組菌株條帶相同，包括空白土壤分離E.coli；其次為Ⅰ型(59株)、Ⅴ(31株)、Ⅹ(11株)；剩余41株分布在其他10種型，部分聚類圖見圖1。2株苜蓿地樣品分離E.coli在Ⅳ和ⅩⅢ型，與同年糞(土)樣分離菌株基因型相同。奶樣分離E.coli的86.90%(73/84)聚在Ⅳ、Ⅰ、Ⅴ型，Ⅵ、Ⅷ、ⅩⅣ型無分布；90.48%與同年的糞(土)分離菌株同聚一型。

圖1 大腸桿菌ERIC-PCR基因分型的部分聚類樹狀圖Fig.1 Part of the cluster tree of ERIC-PCR typing of E. coli

2.3 系統進化分群結果

338株E.coli被分為6個群，B1群占比最大，為75.45%(255/338)，其次是A、C、D或E和F群，分別為18.34%(62/338)、2.96%(10/338)、1.18%(4/338)和0.30%(1/338)。2018和2019年奶源分離菌各1株未分型。不同來源E.coli均B1群占主導。大育成牛運動場糞土源E.coli只有B1群；病牛糞土源E.coli系統進化群最豐富，詳情見圖2。

A.原糞樣品；B.奶樣；C.運動場糞土樣品。ND.未分類的；占比(Y軸)=某種樣品某群菌株數/本樣品總菌株數×100%A.dung samples;B.milk samples;C.manure samples.ND.Unclassified；Percentage (Y-axis)=number of certain type bacteria in a sample /total bacteria in the sample×100%圖2 不同樣品分離E. coli的系統進化分群類型分布及占比Fig.2 Distribution and proportion of phylogenetic groups of E. coli isolated from different samples

3 討 論

自然界E.coli廣泛分布，可通過糞便和廢水排入環境，通過食物鏈進入人體，一些致病性E.coli不僅給畜牧業發展造成危害，還威脅人類健康[10]。因此，了解養殖環境E.coli流行情況及遺傳進化分群關系對預防疾病和維護健康至關重要，故本試驗以養殖場環境E.coli為研究對象。本研究67.46%的分離率，與山東地區牛糞便和場污水78.6%和71.4%的分離率不同[11]；糞樣分離率與新疆不同日齡犢牛糞源E.coli的分離率[12]相同。受地理位置、管理方式、糞便處理方法、采樣因素的影響，分離率存在差異。

ERIC-PCR分型是高效、便捷、低成本的分子分型方法，是基于基因間重復共有序列進行PCR擴增，由條帶數目及大小進行分型，用于評估菌株的遺傳多樣性和親緣關系。Staji等[13]發現，同一來源分離菌株基因存在差異，不同來源也可有較近的親緣關系。鄭曉風等[14]用ERIC-PCR方法發現菌株間存在交叉傳播。本研究將E.coli分為14種型，可見其廣泛的DNA多樣性。90.48%奶樣分離菌株與糞(土)分離菌株親緣關系較近，表明E.coli會通過多途徑水平傳播。基于ERIC-PCR，27株O157：H7E.coli分為8種型[15]；我國華東地區的103株臨床乳腺炎E.coli被分為10個型[16]。本試驗ERIC基因多樣性與上述報道存在差異，可能因地理位置、血清型不同造成。

E.coli致病力與系統發育群有關[17]。胃腸道黏膜上的共生E.coli無致病性，通常為A和B1群；引起腸道感染的大都為A、B1或D群；引起腸外感染的分布于B2和D群[18]，說明A和B1群為條件致病性，B2和D群致病性較強。本研究分離E.coli大都是條件致病性的，分階段管理、提高飼養水平、及時并合理處理糞便可減少動物發病。張星星等[19]報道新疆腹瀉犢牛糞源E.coli主要為A群，其次是D、B1、B2群；佟盼盼等[20]報道新疆地區牛源產志賀毒素E.coli(STEC)以A群為主(94.74%)，E群2.39%，B1、D和F群較少；張德顯[21]調查發現A群是遼寧地區臨床乳腺炎E.coli優勢群；本研究顯示，奶牛養殖環境中E.coli主要為B1群，其次為A群，還有5.62%的C+D+E+F群；與上述兩報道不一致，一方面可能是早期的方法將C群歸入A群，而本文采用了最新的方法；另一方面樣品來源不同，可能影響試驗結果。本研究未檢測到B2群，與馬帥等的研究[22]相比多出分離自病牛運動場糞土的F群；Sarowska等[23]報道F群與B2群相關，本研究結果與Sarowska等的報道相吻合。Rehman等[24]和Bessalah等[25]用最新方法分別研究腹瀉牦牛源和不同健康狀況駱駝源E.coli，結果顯示分別以A(79.5%)和B1群(53%)為主。本結果與其結果存在不同，這些差異可能與動物種類、健康狀況及地理位置有關，需進一步研究證實。

4 結 論

通過對E.coli的分離鑒定，共獲得非重復菌株338株；ERIC-PCR將其分為Ⅰ～ⅩⅣ共14種型，Ⅳ型為優勢型；不同時間、生長階段及來源E.coli的系統進化分群以B1群為主。