褪黑素的添加減輕豬精原干細胞的氧化損傷

黃誠彧，徐德全,2,3，馮 哲，周 玲，劉 敏,2*

(1.華中農業大學動物醫學院，武漢 430070；2.農業部豬遺傳育種重點開放實驗室，武漢 430070；3.農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070)

褪黑素(melatonin，MT)首次提取自牛的松果腺，其主要由色氨酸在酶催化作用下形成。MT微量存在于多種生物體內，細菌、單細胞真核生物、藻類、植物、無脊椎動物和脊椎動物都要由它參與維持正常生物活動，主要影響糖和脂質的代謝、氧化應激防御、活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除、防止癌變及免疫調節等[1-2]。MT對干細胞具有多種調控作用，其中，腦組織中松果腺分泌的MT含量很高，有改善組織損傷，預防神經退行性疾病發生的作用[3]。方佳[4]通過添加MT處理犬間充質干細胞，發現MT可有效緩解細胞衰老，激活抗氧化基因NRF2表達，并在異種移植后取得良好成效。Gao等[5]發現，MT能顯著提高誘導多能干細胞的重編程效率，下調凋亡基因P21和P53的表達，誘導后的干細胞可表達OCT4、SOX2、NANOG等標志基因。MT還可在癌癥治療過程中充當生殖細胞的保護劑，能有效緩解白消安等抗癌藥物對精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的損害，但對SSCs本身會有何種影響仍有待研究[6]。

SSCs是雄性動物體內精子發生的基礎，也是唯一能將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細胞[7-8]。隨著SSCs移植技術的出現，人們開始逐漸關注SSCs對精子品質的影響作用。豬作為一種重要的經濟牲畜，利用SSCs來提高公豬的繁殖能力是新的研究方向。而豬SSCs的敏感性使其易受外界物質的影響，因此，找尋可以促進SSCs增殖分化的有益物質，或研究有害物質對SSCs損傷機制以制定保護方案，對提高公豬的生產性能有著重要的意義。本研究以分離自7日齡大白公豬的SSCs作為試驗材料，希望通過研究MT對公豬SSCs的影響及作用機制，進而應用到生產中達到提高公豬繁殖性能的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物組織采集 睪丸組織采集于華中農業大學精品豬場提供的3頭7日齡健康大白公豬，酒精擦拭消毒并切開陰囊進行睪丸摘取手術，獲取的睪丸用酒精沖洗消毒后放置在冰盒中于30 min內帶回實驗室用于細胞分離。

1.1.2 主要藥品試劑及儀器 RIPA 裂解液、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、ROS檢測試劑盒、脂質氧化MDA檢測試劑盒、總谷胱甘肽檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；褪黑素購自北京百靈威科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養基購自 Gibco 代理公司；膠質細胞神經源性因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)購自武漢匯宇誠生物科技有限公司；TRIzol、PVDF膜及熒光定量板購自莫納生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 購自 Bimake 公司；IV型膠原酶、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素購自Hyclon公司；Western blot 試劑盒購自武漢賽維爾生物技術有限公司；β-tubulin、Bax、總Caspase3、Bcl-2、UCHL1抗體購自 ABclonal 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 購自碧云天公司；SOD2抗體購自Bioswamp公司；CCK-8 試劑盒(cell counting kit-8,Cat No.40203)購自上海翊圣生物科技有限公司；豬ST細胞購自武漢大學細胞庫。

熒光定量RT-qPCR儀 LightCycler480 型(Roche 公司)；CO2細胞培養箱(德國 MEMMERT 公司)；凝膠成像系統(美國 IBM 公司)；Western blot電泳儀(武漢賽維爾生物技術有限公司)；PerkimELmer 2030 酶標儀(聯想生物有限公司)。

1.2 飼養層細胞制備

傳代培養豬支持細胞(sertoli cells，ST)，當細胞密度長至80%左右加入15 μg·mg-1的絲裂霉素C，在37 ℃培養箱內孵育1 h。孵育完成后使用PBS沖洗3次ST細胞以清除殘留的絲裂霉素C。獲得的ST細胞即成為飼養層細胞，可按需求使用或凍存。

1.3 豬睪丸細胞分離純化

1.3.1 細胞懸液制備 采集7日齡大白豬睪丸，酒精消毒后于30 min內帶回進行細胞分離。用無菌手術刀切開睪丸外側漿膜白膜并剝離睪丸實質，滴加PBS沖洗3次，剪碎成2～3 mm3大小組織塊。剪碎的組織加入3倍體積膠原酶IV于37 ℃消化25 min，如觀察到生精小管則表示消化完全。加入3倍體積胰蛋白酶與DNAseI于37 ℃消化20 min，如消觀察到生精小管被消化則表示消化完全，加入含血清培養液終止消化。依次經200和400目細胞篩過濾，過濾后的液體即為睪丸細胞懸液。

1.3.2 差速貼壁法純化細胞 將0.1%明膠溶液覆蓋于培養皿底層在37 ℃環境中包被30 min，包被完成后，在使用前PBS沖洗3次以去除多余明膠。過篩后的細胞懸液加入培養皿中，在37 ℃培養箱中進行差速貼壁。其中，第一次差速貼壁過程持續2 h，將漂浮在培養液中的未貼壁細胞移至新培養皿中。第二次差速貼壁過程4 h，漂浮在培養液中的未貼壁細胞轉移至飼養層細胞上培養。

1.4 SSCs的堿性磷酸酶染色

棄去細胞培養液，PBS清洗細胞去除殘留血清成分。加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，固定期間配制堿性磷酸酶染色液，染色液需現用現配，避光4 ℃保存。棄去4%多聚甲醛，PBS清洗2～3遍以除去殘留，加入染色液避光孵育10～20 min。棄去染色液，PBS清洗后在顯微鏡下觀察染色情況。

1.5 SSCs的免疫熒光染色

挑SSCs克隆至細胞爬片上培養，待細胞長至合適狀態使用PBS清洗3次去除血清成分。加入4%多聚甲醛沒過細胞，固定30 min后PBS清洗殘留的多聚甲醛。加入0.1% Triton X-100透化細胞10 min，PBS清洗細胞爬片。加入10% 胎牛血清、1% 牛血清白蛋白的封閉液緩沖液，封閉細胞30 min。在封閉液中稀釋抗體，4 ℃一抗孵育過夜、37 ℃二抗孵育1 h，樹脂封片后觀察。由武漢賽維爾生物技術有限公司負責制作。

1.6 引物設計

在NCBI數據庫查中下載基因蛋白編碼(CDS)區序列作為模板，通過Oligo 7軟件設計引物后，將引物序列發至上海生工生物有限公司進行合成。引物序列見表1。

高文鵬的這個信息太重要了，對我更重要。決定景花廠命運的關鍵時刻來了，而且，決定我命運的關鍵時刻也來了。我要把自己的命運和景花廠的命運緊密聯系在一起。景花廠的前景雖然不容樂觀，但不管前路多么曲折，我都有信心。我甚至看到了景花廠百轉千折后的柳暗花明，看到了我和阿花風雨同舟后的明媚春光。阿花再高不可攀，但畢竟是個女人，只要她沒有看破紅塵，就必定會有男人能走進她的心靈深處。

表1 基因引物序列Table 1 The sequences of gene primers

1.7 褪黑素處理SSCs

將MT粉末溶于DMSO中配制母液于-20 ℃避光保存，使用時提前解凍并用細胞培養液稀釋。SSCs傳代至細胞平板中培養，待細胞長至90%匯合度左右加入含添加物的細胞培養液進行處理。設置MT濃度梯度(0、50、250、500、1 000 μmol·mL-1)組處理SSCs，每組設3個試驗重復，空白對照組加入0.1% DMSO處理。

1.8 SSCs的總RNA提取及cDNA合成

細胞總RNA利用TRIzol法提取，經核酸濃度測定儀測定濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA質量。使用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.9 實時定量PCR檢測

依據定量PCR試劑盒配制反應體系，使用LightCycler 480 Real-Time PCR Detection System進行實時定量PCR擴增，LightCycler?480 Software1.5軟件收集定量PCR數據。定量體系(2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補足至10 μL)于95 ℃預變性3 min。40個循環：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s。

數據分析以β-actin為內參基因，按照2-△△Ct方法計算各基因相對表達豐度。每個樣品設有3個獨立生物學重復，每個重復進行3個技術重復。

1.10 CCK8檢測SSCs的細胞活力

將SSCs傳至96孔細胞板中培養，每孔加入100 μL含添加物的細胞培養液培養，進行檢測前先用PBS清洗2～3次去除添加物殘留。各處理組設6個生物學重復，同時建立不含細胞的空白對照組，在每孔中加入100 μL常規細胞培養液和10 μL CCK 8。37 ℃溫箱中孵育30～60 min，放入酶標儀內檢測并記錄450 nm波長吸光度。計算各孔細胞的細胞活力，計算公式為：細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100。其中，A(加藥)為具有細胞、CCK8溶液、藥物溶液孔的吸光度；A(對照)為具有細胞、CCK8溶液而不含藥物孔的吸光度；A(空白)為只含有培養液、CCK8溶液孔的吸光度。

1.11 SSCs的總ROS檢測

按1∶1 000比例添加Rousp處理30 min設置陽性對照，用無血清培養液稀釋DCFH-DA濃度為10 μmol·L-1，對于6孔板每孔加入稀釋液不能少于1 mL。37 ℃細胞培養箱內孵育20 min后，用無血清培養液洗滌細胞3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.12 SSCs的總GSH含量檢測

離心收集細胞，加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液并充分震蕩。然后利用液氮和37 ℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融，4 ℃或冰浴放置5 min后，4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清用于總谷胱甘肽(glutathione，GSH)的測定。在96孔 板中加入10 μL樣品和150 μL總谷胱甘肽檢測工作液，孵育5 min后加入50 μL (0.5 mg·mL-1)NADPH，室溫孵育25 min并利用酶標儀測定412 nm 吸光度。

1.13 SSCs的總蛋白提取及凋亡蛋白的Western blot檢測

根據蛋白大小按照Western blot試劑盒(賽維爾)內推薦濃度制膠。分別制作10%分離膠與5%濃縮膠，蛋白點樣后90 V電壓下電泳25 min，確保條帶位于兩層膠交界處。120 V電壓繼續電泳50 min，至蛋白marker完全分離。剪取PVDF膜浸泡在甲醇中激活5 min后，確保PVDF膜與蛋白膠之間無氣泡并能完全覆蓋,將轉膜夾安裝在電泳槽中，加入預冷的轉膜液，埋在冰中用200 mA穩定電流轉膜1 h。PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，與37 ℃搖床100 r·min-1孵育2 h。抗體按需求提前稀釋，一抗4 ℃孵育過夜，二抗與37 ℃ 搖床100 r·min-1孵育1 h。清洗PVDF膜，加入顯影液后放入化學發光圖像分析系統采集圖像，利用ImageJ 軟件進行條帶光灰度值分析。

1.14 數據統計與分析

數據統計分析及作圖使用Praphpad prism 5軟件，兩組間數據差異采用t檢驗分析。無差異時不表示(P>0.05)，差異顯著以*表示(P<0.05)，差異極顯著時以**表示(P<0.01)。

2 結 果

2.1 豬SSCs的鑒定

2.1.1 細胞形態學觀察 分離的細胞培養至14 d 左右時，團塊大小和數量不斷增大，并可用肉眼觀察到細胞培養板中的白色克隆團(圖1A)。在400倍 顯微鏡下觀察克隆團，可觀察到克隆團主要由無色圓形細胞聚集而成(圖1B)。本研究在培養豬SSCs過程中發現，單獨的SSC呈圓形或橢圓形，并且在體外培養過程中單獨的細胞會聚集轉變為有立體結構的圓簇型或葡萄簇型，符合SSCs體外培養的生長特性[9-10]。

A.細胞克隆團；B.顯微鏡觀察細胞克隆團(400×)A.Cloning cluster;B.Microscopic observation of the cell clones(400×)圖1 克隆團細胞形態學觀察Fig.1 Observation of the morphology of clonal cells

2.1.2 AKP染色鑒定克隆樣細胞 AKP染色前觀察細胞狀態，圓簇型克隆團及飼養層細胞處于無色透明狀態(圖2A)。染色后觀察，克隆團細胞被染為棕褐色，飼養層細胞大部分不著色(圖2B)。可初步說明克隆團內存在SSCs。

A.AKP染色前克隆團無色透明；B.AKP染色后克隆團著深褐色A.The clone cluster is colorless and transparent before AKP staining;B.After AKP staining,the clone cluster with alkaline phosphatase positive is dark-brown圖2 克隆團細胞堿性磷酸酶染色Fig.2 Alkaline phosphatase staining of clonal cells

2.1.3 SSCs分子標記檢測 實時定量PCR檢測結果表明，干細胞標志基因OCT4在克隆團細胞中表達量顯著高于ST細胞與間質細胞(leydig cells，LY)(圖3B)；SSCs標志基因NANOG在克隆團細胞中表達量顯著高于ST細胞與LY細胞(圖3 A)；SSCs標志基因PLZF在克隆團細胞中表達量顯著高于ST細胞與LY細胞(圖3C)。表明克隆團主要由SSCs組成。

A.NANOG基因的表達差異；B.OCT4基因的表達差異；C.PLZF基因的表達差異。*.P<0.05；**.P<0.01，下同A.Difference in expression of NANOG gene;B.Difference in expression of OCT4 gene;C.Difference in expression of PLZF gene.*.P<0.05；**.P<0.01,the same as below圖3 實時定量PCR檢測標志基因表達量Fig.3 Quantitative real-time PCR detection of marker genes expression

2.1.4 細胞免疫熒光檢測 熒光顯微鏡下觀察處理后的細胞爬片,其中DAPI將所有細胞核染出。調整熒光鏡片，可觀測到UCHL1及SOX2抗體陽性熒光反應(圖4)。將兩組結果組合，發現熒光抗體陽性反應主要集中于細胞克隆團處，克隆團周圍其它細胞無熒光信號。結果表明，克隆團細胞特異性表達SSCs標記基因UCHL1與干細胞標志基因SOX2。

2.2 MT對SSCs的影響

2.2.1 MT提高豬SSCs活力 設置MT濃度梯度組處理SSCs，經CCK8細胞活力檢測發現，各濃度組在處理細胞24 h時，細胞活力無顯著差異；各濃度組在處理48 h時，MT濃度50 μmol·mL-1以上的處理組細胞活力較對照組顯著上升(P<0.05，圖5)。結果表明，MT具有提高豬SSCs細胞活力的作用。

A.48 h時各處理組與對照組間存在顯著差異(P<0.05)A.There is a significant difference between the treatment groups and the control group at 48 h(P<0.05)圖5 MT對豬SSCs活力的影響Fig.5 Effect of MT on the cell viability in SSCs of pigs

2.2.2 MT降低豬SSCs ROS水平 Rosup處理細胞作為陽性對照(圖6A)，不同濃度MT處理細胞48 h后檢測各組熒光強度(圖6B～D)。將各組熒光結果進行量化，50 μmol·mL-1處理組ROS水平與對照組無顯著差異，250 μmol·mL-1處理組ROS水平顯著低于對照組(P<0.05，圖6E)。結果表明，MT處理SSCs后可降低細胞內ROS水平。

A.Rosup處理細胞30 min；B.DMSO處理細胞48 h；C.50 μmol·mL-1 MT處理細胞48 h；D.250 μmol·mL-1 MT處理細胞48 h；E.ROS熒光強度量化A.Rosup treatment of cells;B.DMSO treated cells for 48 h;C.50 μmol·mL-1 MT treatment for 48 h;D.250 μmol·mL-1 MT treatment for 24 h;E.Quantification of ROS fluorescence intensity圖6 MT對豬SSCs內ROS含量的影響Fig.6 Effect of MT on the content of ROS in pig SSCs

2.2.3 MT提高豬SSCs GSH含量 稀釋谷胱甘肽(glutathione，GSH)標準品為2、5、10、15、25 mol·L-1制作標準曲線(圖7A)。檢測發現，50 μmol·mL-1MT處理SSCs 48 h后細胞內GSH含量無顯著變化，250 μmol·mL-1MT處理SSCs 48 h后，細胞內GSH含量極顯著上升(P<0.01，圖7B)。結果表明，MT添加后可提高SSCs內GSH含量。

A.GSH濃度標準曲線；B.不同濃度MT處理48 h后GSH含量A.GSH concentration standard curve;B.Changes in GSH content after treatment with different concentrations of MT after 48 h圖7 MT對豬SSCs內GSH含量的影響Fig.7 Effect of MT on GSH content in pig SSCs

2.2.4 MT抑制凋亡蛋白表達 選用50、250 μmol·mL-1濃度MT處理細胞48 h后提取蛋白。蛋白條帶結果顯示，50與250 μmol·mL-1處理組總Caspase 3、Bax凋亡蛋白亮度隨著MT濃度增加而變暗，Bcl-2抗凋亡蛋白亮度無明顯變化(圖8A)。量化蛋白條帶灰度值，檢測到到250 μmol·mL-1組總Caspase 3表達量極顯著低于對照組(P<0.01，圖8C)，50 和250 μmol·mL-1組Bax/Bcl-2比值顯著低于對照組(P<0.05，圖8 B)。

A.凋亡蛋白條帶分析；B.Bax/Bcl-2量化蛋白條帶灰度值量化；C.Caspase 3量化蛋白條帶灰度值量化A.Band analysis of apoptotic protein;B.Quantification of gray value of Bax/Bcl-2 protein band;C.Quantification of gray value of Caspase 3 protein band圖8 MT對豬 SSCs內凋亡蛋白表達的影響Fig.8 Effect of MT on the expression of apoptotic protein in pig SSCs

3 討 論

對SSCs的研究需要大量活性和純度高的細胞，因此，幼齡動物的睪丸是理想的實驗材料。本研究選用了7日齡大白豬睪丸進行細胞分離，此時生精小管內SSCs細胞數量處于一個巔峰狀態，且分化進程還未發生。SSCs起源于胚胎外胚層，與胚胎干細胞具有相同的特性，單個細胞呈圓形或橢圓形，細胞直徑約為9～12 μm，胞內除線粒體、核糖體外其它細胞器均不發達[11]。Zhang等[12]分離PIC豬的生殖細胞，在培養過程中細胞會發生聚集形成SSCs群落。Zhao等[9]通過分離巴馬香豬的SSCs發現，體外培養的SSCs會聚集成圓簇狀或葡萄簇狀的克隆團。本研究在培養分離的細胞3 d后觀察到細胞開始聚集，7 d后觀察到結構緊密的細胞簇出現，挑克隆觀察發現，由若干圓形細胞構成，培養過程中具有SSCs的生長特征。

SSCs的分離純化是進行體外培養及研究的基礎。最早人們利用胰蛋白酶、DNase Ⅰ曾成功分離出小鼠SSCs，后經不斷完善，利用膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶及DNase Ⅰ分步消化是最為常用的方法[13]。膠原酶Ⅳ可以消化睪丸組織中的細胞間質，胰蛋白酶消化使細胞分散，而DNase Ⅰ可以消化漂浮的DNA防止細胞黏連。本研究以觀察到生精小管的出現表示膠原酶Ⅳ消化完全。胰蛋白酶主要作用是使細胞分散，本研究中，為避免消化時間過長對SSCs造成損傷，以能觀察到大部分生精小管被消化表示胰蛋白酶消化完全。

SSCs常用的純化方法是差速貼壁法，其利用了不同細胞間貼壁速率差異的特性。將細胞懸液在明膠基質或層黏連蛋白包被過的培養皿上短時間培養，SSCs由于貼壁能力差，短時內只會松散依附在其它細胞上層。此時輕輕吹打后收集未貼壁細胞，并對此進行多次貼壁培養，最終即可得到相對純度較高的SSCs[14]。此方法一般用于分離小鼠或大鼠等動物的睪丸細胞，但近年來有也有用此方法成功分離出牛和豬等大型動物SSCs的報道[15]。本研究共進行了兩次差速貼壁獲得3批細胞，其中第3批細胞在培養7 d后可觀察到大量SSCs樣克隆團出現。由于SSCs差速貼壁后仍無法與其它細胞徹底分離，故進行后續試驗前應采用挑克隆培養方式進一步純化。

AKP染色是常用的干細胞鑒定方式。未分化的干細胞膜上具有高水平的AKP表達，利用試劑盒可使細胞內的AKP水解生成奈酚，與重氮鹽結合后呈藍紫或深褐色顯現，此方法已在小鼠上成功鑒定出SSCs[16-17]。Zhao等[9]通過AKP染色鑒定出了巴馬香豬的SSCs，陳庭鋒[10]通過AKP染色鑒定出了姜曲海豬的SSCs。為避免染色過深造成視野不清晰，本研究的避光染色過程中為15 min，染色后可明顯觀察到細胞克隆團著棕褐色，表明克隆團細胞中存在SSCs。

有報道稱，一些分子可作為豬SSCs標志物,但由于其自身功能復雜等原因，特異性及敏感度較高的SSCs標志物仍無法統一[18]。OCT4(POU5F1)屬于POU轉錄因子家族的V類，是干細胞中普遍表達的特異性基因，其表達量會隨著干細胞分化的進行而不斷下降[19]。SOX2屬于SOXB1亞家族，作為一種干細胞中常見的標志物，在SSCs及其起源早期原始生殖細胞(primordial germ cell,PGC)中都有表達[20-21]。Buaas等[22]在小鼠中敲除PLZF基因后發現，小鼠產生生殖缺陷，染色后觀察到PLZF與OCT4在未分化SSCs中共表達，可作為標志基因。NANOG被發現在豬SSCs內特異性表達，表達量會隨著動物年齡增長而不斷下調[23]。UCHL1(PGP9.5)全稱泛素末端水解酶1，被證實在豬、牛、水牛、山羊SSCs上特異性表達，現常作為家畜生殖細胞鑒定的有效標志物[24]。本研究選用睪丸內常見的ST細胞和LY細胞作為對照，利用實時定量PCR的方法檢測標志基因在不同細胞中表達量的差異。從結果可以看出，克隆團細胞中干細胞標志基因OCT4及SSCs標記基因NANOG、PLZF表達量均顯著高于對照組，說明，克隆團細胞主要由SSCs組成。采用細胞免疫熒光法處理細胞，經熒光顯微鏡下可觀察到克隆團處具有熒光反應，證明克隆團細胞表達SSCs的標記基因UCHL1與干細胞標志基因SOX2。通過上述鑒定結果可證明，培養得到的克隆團細胞主要為SSCs。

MT作為一種調控動物生殖發育的重要激素，在動物生殖系統中分布廣泛。有研究稱，MT能顯著提高精子質量和活力，增強受精過程中精子的超活化作用，可充當凍精保護劑使用[25]。Gholami等[26]對移植了SSCs的小鼠連續10 d注射MT，HE染色后發現，注射MT小鼠生精小管內細胞的形態明顯好于未注射MT的小鼠。對于體外培養的卵母細胞，MT能顯著提高細胞的成熟，并保護細胞免受氧化應激的影響[27-28]。雖有關MT作用的報道已有很多，但其是否對豬SSCs有直接影響仍未見報道。本研究設置了若干MT濃度組處理SSCs，發現在處理48 h后50 μmol·mL-1以上試驗組細胞活力發生顯著升高。表明MT對豬SSCs的細胞活力有促進作用。

精液冷凍過程中常用MT作為保護劑使用。李崇陽[29]通過研究奶牛性控凍精后發現，MT能有效緩解精子解凍過程中產生的ROS。本研究在添加MT后發現，SSCs內ROS含量隨MT濃度的上升而下降，GSH含量隨著MT濃度的升高而上升。上述結果說明，MT是可通過提高SSCs內GSH含量來清除細胞內產生的ROS，保護細胞不受損傷。另一方面，MT主要通過受體介導G蛋白信號傳導途徑行使生理功能，其中，MT1和MT2受體亞型存在于所有脊椎動物中[30]。Yang等[31]發現，牛ST細胞MT1、MT2 基因表達隨著MT濃度提高而上升。李波[32]在用MT處理小鼠SSCs細胞后檢測到MT1、MT2蛋白表達升高。本研究下一步將驗證MT處理后豬SSCsMT1、MT2基因的表達變化。

細胞在正常生理活動過程中或受到外界刺激對導致ROS含量升高。張明[33]在用鎘處理豬ST細胞后，發現細胞ROS含量上升發生氧化損傷并引發細胞凋亡。有報道稱，通過添加玉米赤霉烯酮而引發氧化損傷的ST細胞中，線粒體會釋放細胞色素C(cytochrome c，Cyt-c)到胞漿中,活化Caspase 9后進一步激活凋亡基因Caspase3的表達[34-35]。另一方面，促凋亡蛋白Bax可轉移至線粒體膜上，形成一條Bax通道來介導Cyt-c釋放的過程[36-37]。同屬于Bcl家族的Bcl-2是抗凋亡蛋白中的一種，除可調節Caspase家族的激活外，其BH1、BH2結構域還會與Bax結合發生異二聚化來限制Bax的凋亡作用，并通過兩者間比例來決定細胞的存亡[38-40]。本研究利用Western blot檢測MT處理后細胞中凋亡蛋白表達情況，發現隨著MT濃度升高凋亡蛋白Caspase 3與Bax/Bcl-2比例發生下降。由于MT能有效清除細胞受外界刺激或代謝過程中產生的ROS，細胞損傷得到抑制促使了凋亡基因表達下調。如后續研究可驗證MT不會對SSCs產生促分化等其他影響，則可考慮在體外培養SSCs的過程中加入MT來保護細胞存活。

4 結 論

添加MT后可促進豬SSCs細胞活力上升，是由于MT可直接清除細胞內產生的ROS，提高了總GSH含量，抑制了凋亡基因的表達。表明MT具有保護細胞不受損傷和促進豬SSCs活力的作用。