日糧魚油對高脂日糧飼喂小鼠發情周期和機體產熱的影響

楊曉華，劉方方，張楓琳，易 鑫，陳 林，束 剛，王麗娜，朱曉彤，高 萍，江青艷，王松波

(華南農業大學動物科學學院 廣東省動物營養調控重點實驗室，廣州 510642)

過多的能量攝入會導致動物軀體不同部位的脂肪沉積。研究報道稱，肥胖會引起內分泌及代謝異常，如代謝率降低[1]、高胰島素血癥[2]和孕酮產生過剩[3]，伴隨著發情周期紊亂[4-5]、多囊卵巢綜合征(PCOS)[6-7]和不孕癥[8-9]。在動物生產中，脂肪沉積會影響母豬繁殖性能，如降低發情率、受胎率和仔豬出生成活率等[10-11]。因此，預防肥胖可以提高母豬繁殖性能，降低女性生殖疾病的發病率，改善動物繁殖性能和人類健康。

根據功能的差異，脂肪組織通常分為3種類型，即白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)、褐色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)和米色脂肪組織。白色脂肪組織主要負責能量儲存[12]；褐色脂肪組織通過解偶聯蛋白1 (uncoupled protein 1,UCP1)解偶聯氧化磷酸化來消耗能量[13]；米色脂肪組織分布在白色脂肪組織中，具有褐色樣表型，此過程稱為褐色化[14]。BAT激活/產熱和WAT褐色化在治療肥胖中具有潛在作用[15-17]，并且BAT激活能夠改善生殖障礙[18-20]。一些營養物質如白藜蘆醇(resveratrol)[21]、蘆丁(rutin)[22]、葉綠醇(phytol)[23]和視黃酸(retinoic acid)[24]已被證明可以激活BAT產熱和WAT褐色化。因此，通過營養干預促進BAT產熱和WAT褐色化是預防肥胖相關生殖功能障礙的有利策略。

魚油中富含大量的n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)，即二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)。n-3 PUFA有多種益處，包括抗炎[25]和預防心血管疾病[26]，而添加魚油能有效預防肥胖的發生[27-28]。此外，n-3 PUFA已被證明可以改善PCOS大鼠的卵巢發育，并對PCOS的生化特性如FSH和脂聯素發揮有益作用[29]。然而，魚油是否能夠緩解高脂飲食導致的發情周期紊亂尚不清楚。

因此，本研究旨在探究日糧魚油對高脂飲食導致的發情周期紊亂和機體代謝的影響，研究結果有望揭示魚油在改善肥胖相關繁殖異常方面的調控作用，為其在動物生產和人類健康中的應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

選取36只4周齡的C57BL/6 J雌性小鼠(購自廣東省醫學實驗動物中心)，在溫度(23±3)℃、濕度(70±10)%的條件下，進行12 h的光-暗循環試驗。適應1周后，將小鼠隨機分為3組(n=12)：對照組、高脂組和高脂+魚油組。對照組飼喂標準嚙齒動物飼料(AIN-93G)，高脂組和高脂+魚油組分別飼喂的高脂日糧(脂肪提供60%能量)和添加5%魚油(等能替代豬油)的高脂日糧。本試驗日糧魚油添加量是根據Halade等[30]試驗中使用的日糧魚油添加量(5%)所確定。小鼠日糧成分組成和脂肪酸組成見表1、表2。試驗期21周。在不同飼養階段，對小鼠體組成、整體代謝、褐色脂肪溫度、直腸(體核)溫度和發情周期等進行檢查。試驗結束后，用二氧化碳麻醉小鼠，眼球取血分離血清，用ELISA試劑盒檢測FSH和E2水平。此外，采集皮下脂肪、腹部脂肪和肩胛間褐色脂肪，稱重后保存于-80 ℃冰箱，以便進一步分析。

表1 試驗日糧組成Table 1 The composition of experimental diets g·kg-1日糧

表2 不同飼糧的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of different diets %

1.2 材料和試劑

魚油由廣州市優百特飼料科技有限公司提供。促卵泡激素和雌二醇檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，β-actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，UCP1和Cyto C抗體購自CST公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 體組成 在12周齡時，用動物體成分和核磁共振成像系統分析儀(MesoQMR23-060H型,Niumag Corporation公司)測定小鼠的體脂含量和脂肪分布。

1.3.2 紅外熱成像和體核(直腸)溫度測定 18周齡的小鼠在25 ℃或4 ℃環境中暴露4 h，自由飲食和飲水。采用紅外數字熱像儀獲取小鼠的紅外圖像，并用紅外數字熱像儀(E60型，FLIR公司)快速報告軟件對iBAT溫度進行分析。用直腸探頭連接數字溫度計測量小鼠的直腸溫度。

1.3.3 發情周期鑒定 對20周齡雌性小鼠進行連續8 d陰道涂片的細胞學檢查，每天觀察一次陰道涂片細胞類型，確定發情周期所處階段。固定小鼠，用移液槍吸取20 μL生理鹽水至小鼠陰道，反復抽吸5次后，將液體均勻涂至整個載玻片，涂片自然干燥后，用甲醇固定3 min，瑞氏染液染色5～8 min，流水緩慢沖洗，吉姆薩染液染色 8 min，最后用自來水漂洗，自然干燥，封片，待檢。各階段的分辨方法如下：發情期(estrous,E)的卵泡會成熟排卵，均為無核角化細胞或有少量上皮細胞；發情前期(proestrus,P)的卵泡快速生長，可見大量有核上皮細胞，少量角化細胞；發情后期(metestrus,M)的黃體生成，具有一半的上皮細胞和一半的白細胞，前者的細胞核較大，且半透明、有皺褶；發情間期(diestrus,D)的黃體退化，可見大量白細胞及少量黏膜和上皮細胞。

1.3.4 整體代謝 在16周齡時，采用綜合實驗動物監測系統(CLAMS)(Promethion Metabolic Screening Systems，美國Sable Systems International公司)測定小鼠的產熱和耗氧量等代謝參數。小鼠稱重后，提前將小鼠放于代謝籠適應2 d后，測定代謝參數1 d，期間自由采食和采水。試驗結束后，小鼠稱重。根據前后體重的平均，統計第3天白天(12 h)和黑夜(12 h)的代謝參數。

1.3.5 蘇木精-伊紅(HE)和免疫組化(IHC)染色 剪取一塊脂肪于多聚甲醇固定24～36 h，脫水后用石蠟包埋，切片(5 μm)，貼片，烘干，用蘇木精和伊紅染色，或用UCP1抗體進行免疫組化染色，拍照。

1.3.6 組織RNA提取和實時熒光定量PCR檢測 按照廣州美基生物科技公司RNA 快速提取試劑盒內的說明書提取腹股溝白色脂肪和肩胛間褐色脂肪RNA。主要步驟為：組織加入裂解液后，勻漿，靜置，氯仿抽提，離心，吸上清，加無水乙醇，過柱，清洗，加入無核酸水溶解RNA。按照以下反轉錄步驟(購自日本TaKaRa公司)反轉成cDNA，主要為：體系一(RNA+oligod(T)18)預變性70 ℃，5 min，結束后立即放至冰盒；體系二(預變性得到的RNA+dNTP+RNase+2×Buffer+M-MLV RTase+DEPC水)溫育(37 ℃，90 min)后滅活反轉錄酶(70 ℃，7 min)。反應結束后，將樣品取出后，置于-20 ℃冰箱中保存。

通過實時熒光定量PCR檢測組織中的UCP1、PRDM16、PGC1α、Cidea和Elovl3基因的mRNA表達，引物序列如表3所示。試驗步驟主要為：cDNA樣品稀釋5倍(20 μL cDNA+80 μL DEPC水)，配置引物工作液(引物母液上下游各10 μL+80 μL DEPC水)，點樣(20 μL體系：3 μL已稀釋的cDNA+6.5 μL無核酸水+0.5 μL引物工作液+10 μL SYBR green)，貼膜后離心、上機，反應程序如表4。最后分析數據，根據公式計算各目的基因的mRNA相對表達量(以β-actin為內參基因)：目的基因mRNA相對表達量=2(Ct 目的基因-Ct 內參基因)。

表3 qPCR檢測的引物Table 3 Primers used for the qPCR assay

表4 qPCR反應程序Table 4 Reaction process for the qPCR assay

1.3.7 蛋白質印跡法 使用RIPA裂解液裂解脂肪組織，勻漿，離心后取上清，使用BCA法測定蛋白濃度，根據濃度，用5X SDS對樣品進行進行等質量蛋白分裝，并99 ℃變性10 min。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，試驗步驟主要為：配置分離膠和濃縮膠(根據美國Bio-Rad公司的Western blot快速制膠試劑盒制膠)，將分離膠和濃縮膠注入板中，插梳子，靜置凝固30 min后，將膠用電泳夾子夾緊放入電泳槽，將電泳液倒入電泳槽，拔梳子，點樣，跑電泳(120 V，60 min)，準備PVDF膜(轉膜前15 min PVDF膜用預冷的甲醇活化)和轉膜液，轉膜(橫流90 mA，65 min(70 ku以下的蛋白分子)或90 min(70 ku以上的蛋白分子))，轉膜結束后將條帶取出，用TBST在搖床上清洗5次，用6%脫脂奶粉封閉2.5 h，TBST洗5次條帶，4 ℃過夜孵育一抗(UCP1(1∶2 000)、Cyto C(1∶2 000)和β-actin(1∶2 000))，TBST洗5次條帶，用二抗室溫孵育1.5 h 后洗滌，曝光。并用Image J軟件分析條帶灰度。

1.4 統計分析

所有數據均以“平均值±標準誤(SEM)”表示。使用Sigmaplot 14軟件進行統計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對各組均值進行差異分析，采用Duncan’s法進行多組數據之間的比較，P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 日糧魚油降低小鼠體脂含量和白色脂肪重量

與對照組相比，飼喂高脂日糧小鼠的脂肪含量增加了21個百分點，但魚油的攝入逆轉了HFD引起的脂肪含量增加，比高脂組降低了10個百分點(P<0.05，圖1A、B)。與此結果一致，日糧魚油能顯著減少HFD導致的皮下和腹部脂肪的增加(P<0.05)，分別減少了1.1和2.8個百分點(圖1C)，且BAT的重量明顯高于對照組和高脂組小鼠(P<0.05，圖1C)。綜上所述，日糧魚油顯著降低雌性小鼠的體脂含量和白色脂肪重量。

2.2 日糧魚油緩解高脂日糧導致的雌性小鼠發情周期紊亂

與對照組相比，HFD能延長小鼠的發情周期(8～10 d)，并降低發情期的時間比例，增加發情間期的時間比例(P<0.05)。而日糧魚油將發情周期縮短到正常天數(4～5 d)，并且恢復HFD導致的發情期縮短和發情間期延長(P<0.05，圖2A、B)。通過計算各組正常發情小鼠與異常發情小鼠的比率發現，高脂組的正常發情小鼠的比率只有18%，而日糧魚油顯著增加正常發情的小鼠比率(75%)(P<0.05，圖2C)。同時日糧魚油能夠增加HFD導致的血清FSH和E2水平的降低(P<0.05，圖2D、E)。綜上表明，日糧魚油可以緩解HFD導致的雌性小鼠發情周期紊亂。

A.體組成；B.脂肪分布；C.不同部位脂肪組織指數。柱子上方，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同A.Body composition;B.Fat distribution;C.Adipose tissue index of different parts.Above the column,different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).The same as below圖1 日糧魚油對小鼠體脂含量和白色脂肪重量的影響Fig.1 Effects of dietary fish oil on fat content and WAT mass of mice

A.發情周期對比圖，橫坐標1～8表示天數；B.發情周期統計圖；C.發情比率統計圖；D.促卵泡激素水平；E.雌二醇水平A.Comparison of estrous cycles，1-8 in the abscissa indicates the number of days;B.Statistical graph of estrous cycles;C.Statistical graph of estrus rate;D.The level of FSH;E.The level of E2圖2 日糧魚油緩解高脂日糧誘導雌性小鼠的發情周期紊亂Fig.2 Dietary fish oil alleviated HFD-induced estrous cycle irregularity in female mice

2.3 日糧魚油改善高脂日糧導致的雌性小鼠能量代謝異常

為探究魚油緩解HFD導致的發情周期紊亂是否與機體能量代謝有關，本研究測定了各組小鼠的代謝狀態。結果顯示，HFD降低小鼠的耗氧量和產熱量，而日糧魚油恢復了HFD導致的耗氧量和產熱量的降低(P<0.05，圖3B～E)。同時，添加魚油使小鼠的直腸溫度顯著升高(P<0.05，圖3A)，與能量代謝增加的表型一致。綜上所述，日糧添加魚油能增強高脂飼喂小鼠的能量消耗和直腸溫度，表明魚油能夠改善HFD導致的小鼠能量代謝異常。

A.直腸溫度統計圖；B、C.耗氧量統計圖；D、E.熱量統計圖A.Statistical graph of rectum temperature;B,C.Statistical chart of oxygen consumption;D,E.Statistical chart of heat圖3 日糧魚油可改善高脂飼喂雌性小鼠能量代謝的異常Fig.3 Dietary fish oil improved the abnormal of energy metabolism in HFD-fed female mice

2.4 日糧魚油促進高脂飼喂小鼠的BAT產熱

由于能量消耗的增加與BAT激活/產熱有關，本研究進一步探索日糧添加魚油能否促進高脂日糧飼喂小鼠的BAT產熱。根據圖4A和4B所示，在25 ℃下，高脂小鼠的iBAT溫度與對照組無顯著差異(P>0.05)，但在4 ℃冷刺激下，高脂小鼠的iBAT溫度顯著降低(P<0.05)。而無論是25 ℃或4 ℃，魚油均能促進高脂日糧飼喂小鼠的iBAT產熱，且增加產熱標志基因(UCP1，PRDM16，PGC1α，Cidea，Elovl3)和蛋白(UCP1和Cyto C)的表達(P<0.05，圖4C～E)。以上結果表明，魚油通過增加BAT產熱基因和蛋白的表達，進而促進高脂飼喂小鼠的機體代謝產熱。

A.肩胛間褐色脂肪溫度紅外圖像；B.肩胛間褐色脂肪溫度統計圖；C.肩胛間褐色脂肪產熱標志基因的mRNA表達；D、E.肩胛間褐色脂肪產熱標志基因的蛋白表達A.Infrared images of iBAT temperature;B.Statistical chart of iBAT temperature;C.The mRNA expression of genes related to thermogenic program in the iBAT;D,E.The relative protein expression of genes related to thermogenic program in the iBAT圖4 日糧魚油促進高脂飲食誘導雌性小鼠的iBAT產熱Fig.4 Dietary fish oil increased iBAT thermogenesis in HFD-fed female mice

2.5 日糧魚油促進高脂飼喂小鼠的iWAT褐色化

WAT褐色化也能促進機體產熱。因此，本研究探討了魚油對iWAT褐色化的影響。HE染色結果顯示，與對照組相比，高脂飼喂小鼠中iWAT的脂肪細胞內脂滴變大，數量減少。然而，添加魚油顯著降低了脂肪細胞內脂滴大小，數量增加(圖5A)。由UCP1免疫組化染色觀察可知，高脂飼喂小鼠中iWAT的UCP1陽性染色變淺，而添加魚油UCP1陽性染色加深(圖5A)。與IHC結果一致，添加魚油可顯著增加iWAT中UCP1、Cyto C等產熱標志基因的蛋白表達(P<0.05，圖5B、C)。以上結果表明，日糧魚油可促進高脂飼喂小鼠中iWAT的褐色化。

A.腹股溝白色脂肪UCP1的HE染色(上)和免疫組化圖(下)；B、C.腹股溝白色脂肪脂肪產熱標志基因的蛋白表達A.Representative HE staining (upper)and immunohistochemistry for UCP1 (lower)of images of iWAT;B，C.The relative protein expression of genes related to thermogenic program in the iWAT圖5 日糧魚油促進高脂飲食誘導雌性小鼠的iWAT褐色化Fig.5 Dietary fish oil promoted iWAT browning in HFD-fed female mice

3 討 論

3.1 日糧魚油對高脂飼喂小鼠脂肪沉積的影響

有文獻報道，魚油可以降低動物體重和脂肪沉積，預防肥胖[28,31-32]。與這些研究一致，本試驗結果表明，魚油可逆轉高脂日糧導致的脂肪含量和白色脂肪重量的增加。也有研究發現，魚油能增加倉鼠[33]和大鼠[34]的iBAT重量，與本試驗結果一致。

3.2 日糧魚油對高脂飼喂小鼠繁殖性能的影響

大量的研究報道，肥胖或高脂飲食會對雌性繁殖性能產生不利影響，如大鼠[35]和小鼠[20]的發情周期紊亂。與這些研究結果一致，本試驗結果表明，高脂飲食導致雌性小鼠發情周期紊亂，降低正常發情率。一直以來，肥胖被認為與女性月經紊亂有關[36]。基于魚油的抗肥胖作用，本研究推測，魚油可以緩解高脂日糧導致的發情周期紊亂。與假設一致，本試驗結果表明，日糧魚油可以緩解高脂日糧導致的發情周期紊亂。同樣，有報道稱，富含EPA或DHA的飲食能促進大鼠排卵[37]，且增加山羊排出卵泡的數量和大小[38]。

發情周期是動物繁殖過程的重要部分，受生殖激素的調控，然而，不規律的發情周期往往伴隨著FSH和E2等生殖激素的變化。本研究中，飼喂高脂日糧的小鼠血清FSH和E2水平顯著降低。有報道指出，超重女性血清的FSH水平低于正常體重的女性[39]。有趣的是，本研究中添加魚油提高了高脂飼喂小鼠血清中FSH和E2的水平，與此結果一致，有報道稱DHA增加了牛卵巢顆粒細胞中的E2濃度[40]。但Bauer等[41]發現，魚油降低了正常體重而非肥胖女性在整個月經周期間的血清FSH水平。本研究與Bauer等[41]研究的結果差異可能是由于研究對象的不同。上述結果說明，攝入富含魚油的高脂日糧可以預防高脂飲食導致的雌性小鼠發情周期紊亂和生殖激素的改變。

3.3 日糧添加魚油對高脂飼喂小鼠BAT產熱和WAT褐色化的影響

本研究還進一步探索了魚油緩解高脂日糧引起的發情周期紊亂的機制。肥胖往往伴隨著能量平衡的變化。因此，本研究通過檢測小鼠的機體代謝產熱發現，日糧添加魚油增加了耗氧量和產熱量，并提高了高脂日糧導致的直腸溫度降低。與此結果一致，有研究表明，魚油增加了小鼠的耗氧量[27,42]和直腸溫度[42]。由于動物可以通過BAT的UCP1解偶聯氧化磷酸化來增加產熱，因此，本研究檢測了小鼠BAT的溫度。結果發現，魚油提高了iBAT的溫度，并伴隨著褐色脂肪細胞標志基因和蛋白的表達的增加，說明魚油可促進BAT的激活/產熱。在人類皮下脂肪細胞培養中發現，與體重較輕的人相比，肥胖個體的UCP1基因表達降低[43]。此外，有研究表明，魚油可改善iBAT中UCP1的表達[28]。基于已有的研究，BAT的移植[44]或BAT激活[45]有利于改善PCOS。同時，本試驗結果顯示，日糧添加魚油顯著增加BAT的含量。因此，本研究揭示了魚油促進的BAT激活或產熱可能有助于緩解發情周期的紊亂。

除了BAT產熱，WAT產熱/WAT褐色化也有助于增加機體產熱[46]。報道顯示，添加魚油可誘導iWAT中UCP1的上調[42,47]，EPA可增加皮下脂肪細胞中UCP1基因的表達[48]。與該報道一致，本試驗結果顯示，日糧魚油促進了iWAT中UCP1基因和蛋白的表達。但Pahlavani等[49]發現，高脂日糧添加EPA(45%的能量來自脂肪)并沒有促進iWAT中UCP1蛋白的表達。兩者研究結果的差異可能是由于魚油的添加量和來源不同，或膳食脂肪含量不同。上述結果表明，魚油促進WAT褐變可能也與增強產熱和改善發情周期紊亂有關。

本研究發現，魚油能夠顯著增加血清中E2的水平。而有研究表明，E2的增加會通過雌激素受體ER-α抑制神經肽Y(neuropeptide Y,NPY)的分泌[50]。NPY是能量消耗的主要調節因子，通過抑制BAT活性而降低能量消耗[51]。并且，在Hu等[45]的研究中發現，BAT的激活能夠改善PCOS，其機制可能是BAT分泌的細胞因子脂聯素改善了胰島素抵抗，進而改善了PCOS。因此，魚油可能通過增加E2的水平，抑制了NPY的表達，從而削弱了NPY對BAT活性的抑制作用，最終BAT的激活介導脂聯素緩解發情周期紊亂。

4 結 論

綜上所述，日糧魚油可緩解高脂日糧導致的發情周期紊亂和代謝產熱降低，其可能與BAT激活/產熱和WAT褐色化過程有關。本研究揭示了魚油在改善肥胖相關生殖異常方面的潛在應用，為改善動物繁殖性能和人類健康提供理論和試驗基礎。