過量賴氨酸對斷奶仔豬及其腸道上皮細胞的影響

賈紅敏，馬永航，賀平麗，譙仕彥,3*

(1.中國農業大學動物科學與技術學院，北京 100193；2.中牧實業股份有限公司，北京 100095；3.生物飼料添加劑北京市重點實驗室，北京 100193)

賴氨酸是豬日糧中的第一限制性氨基酸，賴氨酸的需要量是按照日糧配方中特定的百分比表示。以5～10 kg的斷奶仔豬為例，賴氨酸的需要量與豬的品種、斷奶日齡、日糧類型和養殖條件等因素有關。在適宜范圍內，賴氨酸水平的提高可以促進其他氨基酸的吸收和利用，提高豬的日增重和飼料轉化效率，從而改善豬的生長性能[1-2]。當賴氨酸缺乏時，機體自身蛋白質降解，蛋白質和肌肉組織沉積減少[3]。

氨基酸只有在被腸道吸收后才能被腸外組織所利用[4]，這是畜禽利用日糧蛋白質的重要步驟。研究表明，小腸上皮細胞的增殖與凋亡是維持細胞正常生理活動的重要部分，對發揮腸道的正常功能非常重要。哺乳動物的腸道上皮細胞也是體內增殖與凋亡最快的細胞，平均4～5 d更新一次，此過程需要諸多的營養物質。氨基酸可促進細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移，并維持腸道屏障等功能[5-7]。有研究表明，谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸和谷氨酸可以加快腸道上皮細胞蛋白質的周轉，從而促進細胞的增殖[8]。同時，氨基酸還可參與相關轉運載體的調控，如日糧添加賴氨酸可顯著提高肉雞腸道中b0,+和y+氨基酸轉運載體的表達[9]，也可顯著上調育肥豬回腸中氨基酸和小肽的表達。此外，單獨增加葡萄糖或氨基酸的濃度也會促進成纖維細胞的增殖[10]。

目前，國內外關于賴氨酸過量添加以及營養調控相關機制的研究較少。本研究旨在進一步探究在低蛋白質玉米-豆粕型日糧與體外培養細胞的培養基中添加過量的賴氨酸，對斷奶仔豬生長性能、器官指數、腹瀉率、血液學指標、腸道上皮細胞增殖等指標的影響，并探究其原因，為調整飼料配方中賴氨酸等氨基酸的添加量提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、日糧與細胞

動物飼養試驗在國家飼料工程技術研究中心豐寧動物試驗基地進行。試驗選取144頭28 d斷奶的杜×長×大三元雜交仔豬，初始體重為(8.39±0.02)kg，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復6頭仔豬(3頭 閹公豬和3頭母豬)。各組仔豬分別飼喂含有不同賴氨酸(1.3%、2.6%、3.9%和5.2%)的玉米-豆粕型日糧。除賴氨酸水平外，所有日糧的其他營養成分基本維持在相同水平。根據NRC(2012)中規定的體重在7～11 kg 和11～25 kg仔豬的營養需要量進行配制。

仔豬自由采食和飲水，記錄每日飼養情況和腹瀉情況。飼養28 d后結束試驗，并對所有斷奶仔豬進行稱重。

試驗基礎日糧組成和營養成分見表1。本試驗所用賴氨酸為98%賴氨酸鹽酸鹽，其L-賴氨酸含量≥78%。

表1 試驗日糧組成及營養水平Table 1 Ingredient composition and nutrient levels of the diets %

本試驗使用的細胞是豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)，培養基是添加10%胎牛血清、1%胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉和5 μg·L-1表皮生長因子的DMEM/F12完全培養基。將IPEC-J2細胞接種于培養皿中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養，用細胞計數儀計數，使細胞個數在104個·孔-1左右時進行后續試驗。

1.2 動物屠宰和樣品采集

在試驗結束時(28 d)，從每欄中挑選1頭體重接近該欄平均值的斷奶仔豬。空腹12 h后，用抗凝真空采血管和非抗凝真空采血管從仔豬前腔靜脈采集血液樣品分別用于血常規、血生化和血清氨基酸等指標分析。非抗凝釆血管采集的血液樣品在4 ℃下，以3 500 r·min-1離心10 min分離血清，分裝后置于-80 ℃保存。所有仔豬采取電擊放血法屠宰，取十二指腸、空腸和回腸組織[11]，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗食糜后，將腸段浸沒于4%多聚甲醛溶液中，用于后續的腸道形態和病理分析。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 動物試驗指標測定

1.3.1.1 日糧組分：日糧的干物質、粗蛋白質、總磷、鈣、常用氨基酸分別根據中華人民共和國國家標準GB/T 6435—2014[12]、GB/T 6432—2018[13]、GB/T 6437—2018[14]、GB/T 6436—2018[15]、GB/T18246—2019[16]和GB/T15399—2018[17]相應方法進行測定。

1.3.1.2 生長性能及腹瀉率：記錄并計算0～14 d、15～28 d和0～28 d每欄仔豬的平均日采食量、平均日增重和耗料增重比。每天觀察并記錄每頭豬的糞便情況，并計算0～14 d、15～28 d和0～28 d斷奶仔豬的腹瀉率，腹瀉率=試驗期內該欄仔豬腹瀉的總頭次/(該欄豬頭數×試驗天數)×100%[18]。

1.3.1.3 器官指數：屠宰后，取仔豬的心、肝、脾、肺和腎等器官稱重，并計算器官指數。器官指數 =器官重/體重×100%。

1.3.1.4 血液生理生化指標：取仔豬的血液樣品，抗凝真空采血管采集的血液用多功能全自動血常規分析儀(MindrayBC-2800，深圳，中國)，分析紅細胞計數(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(haemoglobin，HGB)、紅細胞比積(hematokrit，HCT)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)與平均紅細胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)等血常規指標。

非抗凝真空采血管采集的血液樣品，分離血清，測定生化參數[19]和氨基酸等指標。經全自動生化分析儀(Hitachi 7020，Hitachi High-Technologies Corporation，日本)，測定血清中的總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)等生化指標。將0.5 mL血清置于離心試管中，加入1.5 mL磺基水楊酸(4%)，振蕩搖勻，冰浴20 min。再加入氫氧化鋰，充分振蕩搖勻，并吸取2 mL置于專用離心管中，4 ℃條件下11 000×g離心30 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾，采用氨基酸分析儀(S-433D氨基酸分析儀，賽卡姆公司，德國)，通過鋰離子交換色譜柱與茚三酮在130 ℃的環境下進行衍生反應，測定游離氨基酸濃度。免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)及免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)采用比色法，按照試劑盒(北京華英生物技術研究所，中國)說明書，使用全自動生化儀(日立7160型，日立集團，日本)進行測定。鈣(calcium，Ca)、鉀(kalium，K)、鈉(sodium,Na)和氯(chlorine，Cl)等無機離子測定采用離子電極法，按照Beckman試劑盒說明書，使用(貝克曼DXC800，美國貝克曼庫爾特公司，美國)設備進行測定。類胰島素生長因子-I(insulin-like growth factor-I，IGF-I)、胰島素(insulin，INS)、胰高血糖素(glucagon，GLU)等激素指標，按照試劑盒(北京華英生物技術研究所，中國)說明書，使用全自動放免計數儀(r-911型，中國科技大學實業總公司，中國)進行測定。

1.3.1.5 腸道形態：取4%多聚甲醛固定后的十二指腸、空腸和回腸組織，包埋后切為4 μm的切片置于載玻片上，進行蘇木精-伊紅染色操作。每個樣品至少做3張切片，每個切片選取10個完整而典型的絨毛視野，利用 Olympus BX 51 顯微鏡(深圳，中國)觀察小腸形態。通過放大40 × 10倍數，對絨毛高度和隱窩深度進行測量，并計算兩者的比值。統計并記錄每100個腸上皮細胞中杯狀細胞的數目。

1.3.1.6 組織病理學：取經4%多聚甲醛固定后的肝、腎組織，用石蠟包埋后，經過修塊、脫水和包埋等程序后切片，切片制作方法同“1.3.1.5”，用蘇木精-伊紅染色，晾干，在顯微鏡下進行組織病理觀察與分析，并拍攝代表性的樣本。

1.3.2 細胞處理及指標測定

1.3.2.1 不同賴氨酸濃度對IPEC-J2細胞增殖的影響：以DMEM/F12培養基中已含有的賴氨酸濃度0.5 mmol·L-1為對照，將IPEC-J2細胞分別加入1、2、4或8 mmol·L-1的賴氨酸，共5個處理，每個處理10個重復，處理24 h后，通過CCK-8試劑盒測定細胞的增殖情況。

1.3.2.2 氨基酸平衡對細胞增殖的影響：以DMEM/F12培養基中原有的賴氨酸濃度為0.5 mmol·L-1為基礎，按照DMEM/F12培養基中氨基酸的組分及濃度比例(表2)，配制如下處理液：處理1：0.5 mmol·L-1賴氨酸；處理2：2.0 mmol·L-1賴氨酸(4倍濃度)；處理3：2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 其他必需氨基酸(1～9，4倍濃度)；處理4：2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 其他必需氨基酸 + 條件性必需氨基酸(1～15，4倍濃度)；處理5：2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 所有的氨基酸 (1～21，4倍濃度)。將IPEC-J2細胞處理24 h，每個處理10個重復，用CCK-8試劑盒測定細胞增殖情況。

表2 氨基酸的組分及濃度Table 2 Composition and concentration of amino acids

1.3.2.3 堿性氨基酸平衡對細胞增殖情況的影響：以DMEM/F12培養基中原有的賴氨酸濃度0.5 mmol·L-1為基礎，以NRC(2012)中仔豬營養需要的堿性氨基酸比例關系，將IPEC-J2細胞分別加入以下5個處理。處理1：0.5 mmol·L-1賴氨酸；處理2：2.0 mmol·L-1賴氨酸；處理3：2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 0.91 mmol·L-1精氨酸；處理4：2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 0.69 mmol·L-1組氨酸；處理5：2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 0.91 mmol·L-1精氨酸 + 0.69 mmol·L-1組氨酸。每個處理10個重復，處理24及48 h后，用CCK-8試劑盒測定細胞增殖情況。

1.4 統計方法

采用SAS 8.1的GLM模型中的ANOVA程序進行數據統計分析，通過線性和二次效應評估。若不同處理間存在顯著差異，則進一步采用Duncan’s多重比較法進行檢驗。以平均值和SEM來表示統計結果。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬生長性能、器官指數和腹瀉率的影響

由表3可見，增加SID Lys的劑量顯著降低了斷奶仔豬各階段的ADFI和ADG (P<0.05)，提高了F/G (P<0.05)，并呈線性關系(P<0.05)。在1～14、15～28和1～28 d三個階段，1.3%、2.6%、3.9%和5.2% SID Lys添加組之間ADG均顯著降低(P<0.05)。在試驗的任何階段，1.3%和2.6% SID Lys添加組的F/G以及3.9%和5.2% SID Lys添加組的ADFI均無顯著差異(P>0.05)。當日糧中添加高劑量的SID Lys時，斷奶仔豬的生長性能受到顯著影響(P<0.05)。日糧SID Lys含量的提高，對斷奶仔豬的器官指數和腹瀉率無顯著影響(P>0.05)。

表3 日糧添加不同水平賴氨酸對斷奶仔豬生長性能的影響Table 3 Effect of dietary Lys levels on growth performance of weaned piglets

2.2 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬血液常規、血清生化、免疫指標、無機離子和生長激素的影響

從表4可知，日糧SID Lys含量的提高顯著降低了MCV和 MCH(P<0.05)，并呈線性關系(P<0.05)，而對其他的血液常規指標無顯著影響。除Cl-外，日糧SID Lys含量對斷奶仔豬的血清生化、免疫指標、無機離子和生長激素指標無顯著影響(P>0.05)。

表4 日糧添加不同水平賴氨酸對斷奶仔豬血液常規指標的影響Table 4 Effect of dietary Lys levels on haematological parameters in weaned piglets

2.3 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬血清氨基酸的影響

由表5可知，隨著日糧中SID Lys含量的提高，顯著影響了血清中賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和鳥氨酸的水平，其中對必需氨基酸中賴氨酸、亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的影響還呈線性和二次關系(P<0.05)。2.6%的SID Lys添加組與對照組相比，其血清中賴氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸與非必需氨基酸中酪氨酸、鳥氨酸的含量差異顯著(P<0.05)；而2.6%SID Lys日糧添加組與3.9%、5.2%組相比，以上氨基酸的含量基本差異不顯著(P>0.05)。

表5 日糧添加不同水平賴氨酸對斷奶仔豬血清游離氨基酸的影響Table 5 Effect of dietary Lys levels on serum amino acid concentrations in weaned piglets μmol·L-1

2.4 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬腸道形態的影響

如表6所示，十二指腸的腸道形態指標不受日糧中Lys的影響(P>0.05)。隨著日糧中SID Lys含量的提高，空腸的絨毛高度顯著降低(P<0.05)，且呈線性關系(P<0.05)，其中1.3%和2.6%的SID Lys添加組之間、3.9%和5.2%的SID Lys添加組間差異不顯著(P>0.05)。在回腸中，隱窩深度和杯狀細胞個數受SID Lys含量的顯著影響(P<0.05)。

表6 日糧添加不同水平賴氨酸對斷奶仔豬腸道形態的影響Table 6 Effect of dietary Lys levels on intestinal morphology in weaned piglets

2.5 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬組織病理學的影響

對斷奶仔豬組織病理學檢測(圖略)，發現肝組織部分出現空泡和淋巴細胞灶等，腎組織部分出現少數腎球囊輕度擴張或髓質的間質輕度水腫，但組間差異不顯著(P>0.05)。

2.6 不同濃度的賴氨酸對IPEC-J2細胞增殖的影響

本試驗觀察了不同濃度的賴氨酸對IPEC-J2細胞增殖的影響，結果如圖1所示。在DMEM/F12培養基中額外添加賴氨酸時，會對IPEC-J2細胞增殖產生不利影響，當賴氨酸添加量為1 mmol·L-1，IPEC-J2增殖水平降低，當賴氨酸大于2 mmol·L-1時，IPEC-J2的細胞增殖水平顯著下降(P<0.05)，當增加到8 mmol·L-1時，細胞增殖數目降低了26.24%。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，n=6。下同Values with different letters are significantly different (P<0.05),n=6.The same as below圖1 不同濃度的賴氨酸對IPEC-J2細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of lysine on the cell viability of IPEC-J2 cells

根據DMEM/F12培養基中的氨基酸配比模式，觀察了過量氨基酸對IPEC-J2細胞的影響，結果如圖2所示。當IPEC-J2中加入2 mmol·L-1的賴氨酸時，細胞活力顯著降低(P<0.05)；將其他的必需氨基酸濃度提高到相同倍數時，細胞活力有升高的趨勢；將必需氨基酸和條件性必需氨基酸濃度，以及非必需氨基酸同時提高到相同倍數時，細胞活力又顯著降低(P<0.05)。

1.0.5 mmol·L-1 Lysine；2.2.0 mmol·L-1 Lysine(4倍濃度)；3.2.0 mmol·L-1 Lysine +其他必需氨基酸(表2中1～9，4倍 濃度)；4.2.0 mmol·L-1 Lysine + 其他必需氨基酸 + 條件性必需氨基酸(表2中1～15，4倍濃度)；5.2.0 mmol·L-1 Lysine + 所有的氨基酸(表2中1～21，4倍濃度)1.0.5 mmol·L-1 Lysine group;2.2.0 mmol·L-1 Lysine group (4×);3.2.0 mmol·L-1 Lysine + EAA(1-9 in table 2，4×);4.2.0 mmol·L-1 Lysine + EAA + CEAA (1-15 in table 2，4×);5.2.0 mmol·L-1 Lysine + AA (1-21 in table 2,4×)圖2 氨基酸平衡對IPEC-J2細胞增殖的影響Fig.2 Effects of amino acid balance on the cell viability of IPEC-J2 Cells

根據豬營養需要的氨基酸平衡模式，觀察了過量堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸與組氨酸)對IPEC-J2細胞的影響，結果如圖3所示。當IPEC-J2細胞處理24 h時(圖3A)，添加2.0 mmol·L-1Lysine的處理組比添加0.5 mmol·L-1Lysine的對照組，細胞活力顯著下降(P<0.05)；當在處理液中按照相應的比例提高精氨酸、組氨酸以及同時提高這兩種氨基酸時，細胞活力降低，但與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。當IPEC-J2細胞處理48 h時(圖3B)，2 mmol·L-1Lysine的處理組以及相應提高精氨酸、組氨酸的處理組，細胞活力均顯著低于對照組(P<0.05)。

A.IPEC-J2細胞處理24 h；B.IPEC-J2細胞處理48 h.1.0.5 mmol·L-1 Lysine；2.2.0 mmol·L-1 Lysine；3.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1 Arginine;4.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.69 mmol·L-1 Histidine；5.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1 Arginine + 0.69 mmol·L-1 HistidineA.IPEC-J2 cells treated for 24 h;B.IPEC-J2 cells treated for 48 h.1.0.5 mmol·L-1 Lysine group;2.2.0 mmol·L-1 Lysine group;3.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1 Arginine;4.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.69 mmol·L-1 Histidine;5.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1Arginine + 0.69 mmol·L-1 Histidine圖3 堿性氨基酸平衡對IPEC-J2細胞增殖的影響Fig.3 Effects of alkaline amino acid balance on the cell viability of IPEC-J2 Cells

3 討 論

3.1 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬生長性能的影響

隨著氨基酸工業化生產的實現，合成氨基酸開始被廣泛用于豬日糧的配制中，以滿足豬對氨基酸的需要。有研究表明，在日糧中增加 0.1%～0.2%的合成氨基酸可有效節約日糧粗蛋白質至少2%，而降低日糧粗蛋白質水平將最小化必需氨基酸的部分，保證氨基酸營養處于更好狀態。Hahn和Baker[20]的研究結果顯示，斷奶仔豬在飼喂 16%粗蛋白質并補充 0.2%賴氨酸的日糧后，營養物質排出量最少。李德發等[21]報道，賴氨酸含量為1.25%的日糧與賴氨酸含量為1.15%的日糧相比，能夠顯著提高5～7周齡 仔豬的平均日增重，改善氮存留量、氮表觀消化率和凈利用率。譙仕彥等[22]研究發現，將日糧賴氨酸含量由1.21%提高到1.41%能夠改善仔豬生長性能和日糧氮利用效率，提高氨基酸用于合成蛋白質的效率。謝建兵等[23]以ADG為考察指標進行研究表明，斷奶仔豬日糧中總賴氨酸最適宜的水平為1.45%。本試驗中，隨著日糧中賴氨酸添加量的升高，仔豬在斷奶后28 d的生長性能下降，這說明當SID Lys提高到現有需要量的2倍時，對斷奶仔豬的生長產生了不利影響，以SID Lys水平為1.3%的處理最佳。這與在仔豬中，3～4倍的賴氨酸推薦量(1.15%)降低了采食量與體重的報道[24]一致。

賴氨酸水平不同時，豬對其他氨基酸的需要量也會有所差別。當賴氨酸含量達到一定水平后，賴氨酸的利用率會隨著賴氨酸水平的提高而降低。在理想蛋白質模型和低氮日糧限制性氨基酸平衡模式研究中[25]，其他氨基酸與賴氨酸之間存在一定的比例。而在本試驗中，其他氨基酸水平并未隨著SID Lys水平的提高而提高，仔豬不僅無法利用更多的賴氨酸，反而因為需要動用額外的能量來完成賴氨酸的轉化，引起了能量的相對不足，導致了仔豬生產性能指標的下降[26]。

3.2 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬器官指數、腹瀉率、組織病理學的影響

動物器官指數可以被看作是機體機能狀況的反映，作為一個重要的生物學指標對理論實踐和生產都具有重要意義[27]。本試驗在測定器官指數和肝、腎組織病理時，未發現顯著性差異，說明過量賴氨酸(5.2% SID Lys)的添加對器官指數和肝腎并無不良影響。本試驗在保證蛋白質水平一致的情況下，隨著SID Lys的升高，降低了豆粕的使用比例，而大豆中的抗營養因子是引起斷奶仔豬腹瀉的主要原因之一，因此，本試驗全期各處理組仔豬的腹瀉發生率較低。

3.3 日糧添加不同水平賴氨酸對斷奶仔豬血液指標的影響

在評價動物個體或群體的健康狀態和免疫性能時，通常將血液常規作為重要指標[28]。其中，紅細胞負責運輸氧和二氧化碳，其功能主要依賴于紅細胞內的血紅蛋白含量。本試驗中，隨著日糧中SID Lys的升高，MCV和MCH顯著降低，說明高賴氨酸添加組的斷奶仔豬中肝造血功能減弱。在血清生化指標中，AST和ALT通常被視為肝功能的可靠標記物[29]，其水平升高表明肝細胞滲透性增加、肝細胞受損乃至壞死。在本試驗中，AST和ALT含量差異不顯著，說明過量賴氨酸對仔豬的肝細胞未造成損傷，這與肝組織切片的結果一致。UN、T-BIL和CREA都是評價動物腎功能的指標[11]。本試驗中，SUN、T-BIL與CREA差異均不顯著，說明過量賴氨酸未對斷奶仔豬的腎功能造成影響，這與腎組織切片結果一致。

隨著日糧中SID Lys的升高，斷奶仔豬血清賴氨酸含量顯著升高，而精氨酸含量不受影響，這進一步說明賴氨酸和精氨酸不存在拮抗作用，這與Southern和Baker[30]的研究結果一致。有研究表明，如果日糧中的非必需氨基酸總量較少，不能滿足動物機體需求，動物機體將開啟一系列轉氨反應，自行合成非必需氨基酸[31]。因此，飼料中賴氨酸的升高和飼料中必需氨基酸比例的不同，造成了機體氨基酸水平的變化，從而引起了組氨酸、亮氨酸、色氨酸與苯丙氨酸等必需氨基酸以及丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸與鳥氨酸等非必需氨基酸的變化。

3.4 日糧添加不同水平的賴氨酸對斷奶仔豬腸道形態的影響

氨基酸和小肽主要通過小腸進行吸收，而營養物質的消化和吸收明顯受到腸絨毛高度和隱窩深度的影響[32-33]。在本試驗中，過高的賴氨酸水平會減少空腸的絨毛高度和回腸的隱窩深度，這與之前仔豬飼喂賴氨酸缺乏日糧的試驗結論相似[34]，也與施壽榮等[35]在肉雞上的研究結果相似，說明賴氨酸的不足與過量都會影響動物對營養物質的消化與吸收。

3.5 過量賴氨酸對豬腸道上皮細胞增殖的影響

作為一種未完全分化的腸道細胞，IPEC-J2是從初生仔豬的空腸上皮組織中分離出來的[36]，其保持了多種腸道細胞的特征。本試驗采用IPEC-J2細胞系作為體外模型，研究過量賴氨酸對仔豬腸道吸收的影響。

本試驗中，當加入的賴氨酸濃度高于2.0 mmol·L-1時，IPEC-J2的細胞活性顯著降低。張海環[37]的研究表明，對于IPEC細胞，細胞增殖情況隨著賴氨酸的濃度(0、0.5、1.5、4.5和13.5 mmol·L-1)出現先升高后降低的變化，在1.5 mmol·L-1時細胞活力最高，但與0.5 mmol·L-1差異不顯著，這與本試驗的結果基本一致。張海環[37]的研究還證明，當賴氨酸濃度達到1.5 mmol·L-1時，CAT-1,b0,+AT和y+LAT1基因表達量最高，并且這一數值極顯著高于其他賴氨酸濃度組。其中原因也許是這一數值較為適中，既不像在0.5 mmol·L-1時由于賴氨酸濃度過低無法引起調控對象的變化，也不至于在4.5 mmol·L-1以上時由于賴氨酸濃度過大從而對細胞的生長造成不利影響。適當提高賴氨酸和葡萄糖的含量有助于增加賴氨酸轉運載體b0,+AT和y+LAT1的表達[38]。由于賴氨酸本身具有一定的堿性，當賴氨酸濃度過高時，培養基的酸堿程度也會被相應改變，進而影響細胞正常生理活動。同時，當賴氨酸的濃度為1.5 mmol·L-1時，由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與調控的蛋白質合成值可能達到最大[36]，而mTOR不僅是細胞生長調節的重要蛋白質，還在蛋白質合成中發揮重要的作用。因此，當賴氨酸濃度過高時，會影響細胞增殖與蛋白質的合成。

本研究中，當賴氨酸濃度為2.0 mmol·L-1時，同時提高其他必需氨基酸的濃度，盡管與0.5 mmol·L-1濃度組差異不顯著，但IPEC-J2的細胞增殖情況得到了一定的改善，說明氨基酸平衡會影響細胞的增殖。有研究表明，賴氨酸/蛋氨酸配比模式會對奶牛乳腺上皮細胞增殖與酪蛋白合成產生較為顯著的影響[39]，在豬的小腸上皮細胞和骨骼肌細胞中必需氨基酸會通過mTORC1信號通路影響細胞的增殖和蛋白質生物合成[40-41]，添加最優濃度配比的組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和亮氨酸會通過增加激活mTOR信號通路信號蛋白質的磷酸化，從而促進酪蛋白合成相關基因的表達[42]。

本研究中，在2.0 mmol·L-1濃度處理的IPEC-J2細胞中，按照豬對堿性氨基酸需要量的比例補充精氨酸和組氨酸時，隨著處理時間的增加，細胞活力降低，當細胞處理24 h時，補充其他堿性氨基酸的處理組的細胞活性與2.0 mmol·L-1賴氨酸濃度組相比有提高的趨勢，這符合氨基酸平衡模式的要求。有研究表明，0.3 mmol·L-1是上皮細胞增殖與蛋白質轉化適宜的精氨酸濃度[7]，本試驗中添加的精氨酸為0.91 mmol·L-1，顯然已過量，所以細胞的生長受到不利影響。這一過程可能與過量的半胱氨酸通過激活內質網應激和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路來引起細胞壞死[43]的原理相似。

4 結 論

本研究顯示，在玉米-豆粕型日糧中添加過多的賴氨酸對斷奶仔豬的生長產生了負面作用。飼喂添加1.3% SID Lys的日糧時，斷奶仔豬的生長性能最優。SID Lys添加量為2.6%、3.9%與5.2%時，斷奶仔豬的生長性能下降，部分血常規指標、血清游離氨基酸指標和腸道形態均受到不利影響。在IPEC-J2細胞體外試驗顯示，大于2.0 mmol·L-1的賴氨酸對IPEC-J2細胞活力具有抑制作用。綜上，在實際應用中，應充分考慮氨基酸之間的平衡作用。