反芻動物埃立克體熒光定量PCR檢測技術的建立和應用

王素華，王忠才，黃凌哲，莫虹斐，吳紹強，呂繼洲，趙治國，帥江冰

(1.溫州海關綜合技術服務中心，溫州 325027；2.杭州海關技術中心，杭州 310012； 3.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫所，北京 100029；4.呼和浩特海關技術中心，呼和浩特 010020)

反芻動物埃立克體(Ehrlichiaruminantium)是一類專性細胞內寄生的革蘭陰性細菌[1]。由反芻動物埃立克體引起的疾病統稱心水病，是一種人畜共患的自然疫源性疾病[2]，這種疾病幾乎分布在撒哈拉沙漠以南非洲的所有地區和加勒比海的一些島嶼上，并傳播至其他國家，其傳播者主要是鈍眼蜱屬的希伯來鈍眼蜱和美洲鈍眼蜱[3-5]。該病是牛、綿羊、山羊及其他反芻動物最重要的傳染病之一，臨床癥狀包括發熱、食欲不振、呼吸困難和猝死，死亡率高達80%[2，6-7]。心水病的流行與傳播媒介蜱的消長和活動規律相一致，具有明顯的地方性和季節性[1-7]。心水病不僅威脅農牧業健康發展和食品安全，對流行國家造成了巨大的經濟損失，而且被認為是一種潛在的新出現的人畜共患病[8-9]。

早期診斷可以有效控制反芻動物心水病。心水病傳統的診斷方法是基于臨床癥狀的血液涂片鏡檢和血清學檢測，這些檢測方法耗時較長，難以適應快速診斷和控制疫情的需要，也不適合蜱樣本內的Ehrlichiaruminantium檢測[10]。隨著分子檢測技術的快速發展，常規PCR、套式PCR、LAMP和熒光定量PCR等檢測技術已應用于反芻動物血液和蜱體內Ehrlichiaruminantium的檢測[11-13]。這些檢測方法各有優缺點，常規PCR方法特異性和敏感性較低，擴增時容易產生假陽性；LAMP技術污染的可能性較大，條件控制要求比PCR更嚴格；套式PCR方法耗時、污染風險高。為了解決這些問題并滿足定量結果的需要，本研究將TaqMan和Eva Green熒光定量PCR技術應用于反芻動物埃立克體的檢測和定量分析。因其特異性強、敏感性高、安全省時，該技術已在醫學檢測和其他各個領域廣泛應用。反芻動物埃立克體的分子檢測主要集中在pCS20、16S RNA和map1等基因序列或基因家族[14-15]，本研究針對pCS20高度保守和特異的基因片段設計特異性引物和探針，建立pCS20TqM和pCS20EGqPCR檢測方法，以便快速、準確地檢測反芻動物埃立克體，為心水病的防控及分子流行病學研究提供技術支持和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 病原核酸及臨床樣品

反芻動物埃立克體(E.ruminantium)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、牛雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、環形泰勒蟲(Theileriaannulata)、犬埃立克體(E.Canis)、牛埃立克體(E.bovis)、馬埃立克體(E.equi)和立氏埃立克體(E.risticii)的基因組DNA由溫州海關綜合技術服務中心動植物檢疫實驗室提取、合成和保存。鈍眼蜱采自溫州口岸進境鹽漬牛皮，-80 ℃保存于溫州海關綜合技術服務中心動植物檢疫實驗室。

1.2 主要試劑和儀器

Quick-DNATM提取和純化試劑盒購自ZYMO RESEARCH公司；2×TaqMan?Universal Master Mix II購自美國ABI公司；2×SsoFast Eva Green Supermix預混液購自美國Bio-Rad公司；TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、dNTPs(10.0 mmol·L-1)、MgCl2(25 mmol·L-1)、DL5000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。qTOWER3G touch熒光定量PCR儀購自德國椰拿公司；Kingfisher Duo Prime全自動核酸提取純化儀、NanoDrop2000核酸蛋白分析儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 引物探針設計

pCS20是反芻動物埃立克體特異性鑒定基因，根據GenBank中登錄的反芻動物埃立克體pCS20基因(AY236058～AY236069)，用軟件Primer 5.0分別設計TaqMan和Eva Green熒光定量PCR引物和探針，使用FAM熒光素標記TaqMan熒光定量PCR檢測探針；在pCS20基因相對保守區域設計3對引物，選擇最佳引物序列用于Eva Green熒光定量PCR擴增。TaqMan熒光定量PCR引物和探針序列見表1，Eva Green熒光定量PCR引物序列見表2。引物和探針由上海華大基因科技有限公司合成。

表1 pCS20TqM熒光定量PCR引物和探針序列Table 1 Primers and probe for pCS20TqM qPCRs

表2 pCS20EG熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers for pCS20EG qPCRs

1.4 質粒標準品制備

根據NCBI中EhrlichiaruminantiumKwanyanga株pCS20基因序列(GenBank登錄號：AY236063)合成基因片段共1 050 bp，全基因由上海華大基因科技有限公司合成。選擇EcoRⅤ和NdeⅠ兩個酶切位點，將目的基因克隆于pUC57載體中構建重組質粒pUC57-pCS20，重組質粒經鑒定正確后，質粒濃度稀釋為20 ng·μL-1，按照公式(6.02×1023拷貝·mol-1)×質粒濃度(ng·μL-1)×10-9/(DNA長度×660)=1.74 ×109拷貝·μL-1，作為pUC57-pCS20質粒標準品備用。

1.5 優化TaqMan和Eva Green熒光定量PCR反應條件

1.5.1 優化退火溫度 試驗使用qTOWER3G touch熒光定量PCR儀進行擴增和分析，分別以TaqMan?Universal Master Mix II(4440038，ABI,USA)和SsoFast Eva Green?Supermix(1725200，BIO-RAD,USA)作為反應緩沖液。在緩沖液試劑盒推薦的反應體系下進行退火溫度優化，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR分別設置51～60 ℃ 10個整數值梯度退火溫度，反應條件為50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃預變性10 min，然后95 ℃ 15 s變性，51～60 ℃退火延伸1 min并收集熒光，共40個循環。

1.5.2 優化反應體系 分別在確定退火溫度后對引物和探針反應濃度進行優化。以20 pmol·μL-1的引物和10 pmol·μL-1的探針各0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL進行反應，選取最佳引物和探針濃度。TaqMan熒光定量PCR 25 μL反應體系：TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ(2×)12.5 μL，正、反向引物和探針(pCS20 F、pCS20 R和pCS20 probe)各0.25～2.0 μL(6個濃度梯度)，pUC57-pCS20的質粒標準品DNA2.0 μL，加滅菌去離子水補至25 μL。Eva Green熒光定量PCR 25 μL反應體系：SsoFast Eva Green?Supermix(2×)12.5 μL，正、反向引物(pCS20 F1～F3和pCS20 R1～R3)各0.25～2.0 μL(6個濃度梯度)，pUC57-pCS20的質粒標準品DNA2.0 μL，加滅菌去離子水補至25 μL。

1.6 特異性試驗

利用建立的TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法對反芻動物埃立克體、牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體和立氏埃立克體的基因組DNA進行檢測，并以pUC57-pCS20質粒標準品作為陽性對照，以滅菌去離子水作為陰性對照，按照“1.5”確定的方法進行實時熒光定量PCR，評價此方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將pUC57-pCS20質粒進行10倍梯度稀釋，用已建立的反應條件進行TaqMan和Eva Green熒光定量PCR擴增，評價此方法的敏感性。

1.8 重復性試驗

將“1.4”制備的質粒標準品10倍倍比稀釋，使用4個濃度梯度進行重復試驗，將同一批不同稀釋度的標準品按建立的方法重復3次進行組內重復試驗，對3次不同時間段稀釋的同一濃度的標準品進行組間重復試驗，對試驗結果進行統計，分析此方法的重復性。同時設置滅菌去離子水為陰性對照。

1.9 臨床樣品檢測

從美國、烏拉圭、蘇丹和南非等不同國家鹽漬牛皮上采集的硬蜱中選取420只鈍眼蜱，其中美國20只、烏拉圭100只、蘇丹和南非各150只，分別用建立的TaqMan、Eva Green熒光定量PCR方法和OIE推薦的套式PCP方法對420只鈍眼蜱樣本進行檢測。反應時用pUC57-pCS20質粒作陽性對照，用滅菌去離子水作陰性對照。TaqMan和Eva Green熒光定量PCR以出現典型擴增曲線為陽性；套式PCR以電泳檢測時出現目的片段，且基因測序及比對正確為陽性。

2 結 果

2.1 TaqMan和Eva Green熒光定量PCR最優反應條件

經退火溫度和引物、探針反應濃度優化，最終確定了TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法的最佳退火溫度分別為58 ℃和52 ℃，Eva Green熒光定量PCR的最佳引物序列為pCS20 F3和pCS20 R3，稀釋的引物、探針的最佳使用量為0.75 μL。

TaqMan熒光定量PCR反應體系：TaqMan?Universal Master Mix II(2×)12.5 μL，正、反向引物和探針(pCS20 F、pCS20 R和pCS20 probe)各0.75 μL，DNA模板2.0 μL，加滅菌去離子水至25 μL。最終確定該反應的循環參數：50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃ 10 min預變性；然后95 ℃變性 15 s，58 ℃延伸1 min并收集熒光，共40個循環。

Eva Green熒光定量PCR反應體系：SsoFast Eva Green?Supermix(2×)12.5 μL，正、反向引物(pCS20 F3和pCS20 R3)各0.75 μL，DNA模板2.0 μL，加滅菌去離子水至25 μL。最終確定該反應的循環參數：50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃ 10 min預變性；然后95 ℃變性 15 s，52 ℃延伸1 min并收集熒光，共40個循環。

2.2 TaqMan和Eva Green熒光定量PCR標準曲線的建立

將質粒標準品pUC57-pCS20 10倍梯度稀釋后，以7個稀釋度進行熒光定量PCR擴增，通過系統自動分析軟件分析，可以得到以Ct值為縱坐標，質粒標準品濃度對數為橫坐標繪制的熒光定量PCR標準曲線(圖1)。由圖1可知，在102～108拷貝·μL-1的范圍內，兩種熒光定量PCR方法的標準曲線均呈現良好的線性關系，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR線性關系表達式分別為：y=-1.273 lnx+39.307和y=-1.587 lnx+36.932，相關系數R2在0.99以上，擴增效率均高于90%。標準曲線比較理想。

圖1 質粒標準品DNA的標準曲線圖Fig.1 TaqMan and Eva Green Real-time PCR standard curves for pCS20 gene

2.3 特異性分析

利用建立的TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法分別對反芻動物埃立克體、牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體和立氏埃立克體的基因組DNA進行檢測，并以pUC57-pCS20質粒標準品作為陽性對照，以滅菌去離子水作為陰性對照，僅反芻動物埃立克體基因組DNA和pUC57-pCS20質粒標準品出現特異性擴增曲線(圖2)，表明該檢測方法的特異性較好。

1.pUC57-pCS20質粒；2.反芻動物埃立克體；3～10.牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體、立氏埃立克體和陰性對照1.pUC57-pCS20 plasmid；2. Ehrlichia ruminantium；3-9. B. bovis,B. bigemina ,Theileria annulata ,E. Canis ,E. bovis ,E. equi ,E. risticii and Negative control圖2 特異性試驗結果Fig.2 Specific test of TaqMan and Eva Green Real-time PCR assays

2.4 敏感性分析

將濃度為1.74 ×105拷貝·μL-1的pUC57-pCS20質粒標準品進行10倍梯度稀釋，按照所建立的條件，分別進行TaqMan和Eva Green熒光定量PCR擴增。結果表明，TaqMan熒光定量PCR最低可以檢出1.74×101拷貝·μL-1的 pUC57-pCS20質粒，Eva Green熒光定量PCR最低可以檢出1.74拷貝·μL-1的 pUC57-pCS20質粒(圖3)。

2.5 重復性分析

為驗證所建立檢測方法的重復性，對同一批稀釋的標準品按照建立的方法重復3次進行組內重復試驗，并對3次不同時間稀釋的同一濃度的標準品進行組間重復試驗，結果顯示(表3、4)，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR組內檢測的變異系數為0.00～1.46，組間檢測的變異系數為0.49～1.29，表明該方法具有較高的可重復性。

表3 TaqMan熒光定量PCR的組內、組間重復性試驗結果Table 3 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the TaqMan Real-time PCR

表4 Eva Green熒光定量PCR的組內、組間重復性試驗結果Table 4 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the Eva Green Real-time PCR

2.6 臨床樣品檢測

分別采用TaqMan、Eva Green熒光定量PCR和套式PCR對420只鈍眼蜱進行檢測，結果如表5所示，上述3種檢測方法對鈍眼蜱體內埃立克體的檢出率分別為25.48%(107/420)、29.29%(123/420)和24.76%(104/420)。套式PCR檢測的陽性樣品，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR檢測都為陽性；TaqMan熒光定量PCR檢測的陽性樣品，Eva Green熒光定量PCR檢測也都為陽性。對3種檢測方法的敏感性進行分析，Eva Green熒光定量PCR能檢出單個拷貝數的質粒標準品，TaqMan熒光定量PCR和套式PCR能檢出101拷貝·μL-1的質粒標準品，Eva Green熒光定量PCR的敏感性更高，能夠檢出痕量的埃立克體DNA。

表5 TaqMan、Eva Green熒光定量PCR和套式PCR對420個鈍眼蜱樣品的檢測結果Table 5 Results of TaqMan qPCR、EvaGreen qPCR and Nested PCR for 420 Amblyomma samples

1～6.1.74×105～1.74×100 拷貝·μL-1 pUC57-pCS20質粒；7.陰性對照1-6.1.74×105-1.74×100 copies·μL-1 pUC57-pCS20 plasmid；7.Negative control圖3 敏感性試驗結果Fig.3 Sensitivity analysis of TaqMan and Eva Green Real-time PCR assays

3 討 論

心水病是一種致命的細菌性疾病，20世紀在美國首次發現[16]，由反芻動物埃立克次體引起，經鈍眼蜱傳播，在世界范圍內嚴重威脅人和動物健康，曾給人類帶來嚴重災難[8-15]。該病目前主要發生在發展中國家，當前美國反對生物恐怖主義已將埃立克體列入生物戰劑名單[17]。心水病是牛、綿羊、山羊和其他反芻動物最重要的傳染病之一，急性病例死亡率高，一旦出現癥狀則預后不良。隨著“一帶一路”等國家經濟發展戰略的實施與深入推進，我國進出境動物、動物產品和運輸工具不斷增加，外來動物疫病跨境傳入風險逐年加大。反芻動物埃立克體相對于其他微生物而言，繁殖、傳播快，能夠形成氣溶膠，對我國牛羊等反芻動物主要養殖區的威脅隨著進口貿易的發展日益突出，一旦侵入將會給我國牛羊養殖業帶來嚴重經濟損失。因此，迫切需要研發和建立快速簡便、精準有效的檢測方法作為技術儲備。pCS20是一個高度保守和特異的基因，世界動物衛生組織(OIE)推薦的pCS20套式PCR已應用于多種反芻動物血液和蜱樣本反芻動物埃立克體的檢測[11,18-19]，但套式PCR耗時且污染風險高，為了解決這些問題并滿足定量檢測的需要，qPCRs已用于反芻動物埃立克體的檢測和定量分析。Steyn等[14]利用pCS20基因的qPCRs方法對心水病疫區的牛、綿羊和山羊血液及采集的蜱樣本同時進行反芻動物埃立克體DNA檢測，血液樣本的陽性檢出率為3.57%(85/2 381)，蜱樣本的陽性檢出率為24.52%(344/1 403)，作者分析認為有可能是在動物發熱反應之前采集的蜱樣本，血液中病原體含量較低，而飽血蜱體內埃立克體的濃度高于感染動物的血液，因此，以飽血蜱為研究對象的pCS20基因擴增可能更適合于確定反芻動物的埃立克體攜帶狀況。

本研究選取pCS20基因上高度保守的區域，建立了反芻動物埃立克體TaqMan和Eva Green熒光定量PCR，對來自非洲和美洲不同國家的420只蜱進行檢測，以驗證兩種檢測方法的敏感性，并評估心水病疫區媒介蜱感染反芻動物埃立克體的情況。TaqMan熒光定量PCR在PCR擴增體系中加入TaqMan探針，其特異性有引物和探針雙重保證，進一步增加了結果的可信度；Eva Green是一種新型染料，具有更強的熒光信號，Eva Green熒光定量PCR在擴增反應中不易受PCR抑制劑的影響，大大增加了擴增和延伸效率[20-21]。臨床試驗結果表明，本研究建立的TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法敏感性均高于OIE推薦的套式PCR方法，Eva Green熒光定量PCR的敏感度高出TaqMan熒光定量PCR一個數量級。

4 結 論

建立了兩種快速檢測反芻動物埃立克體的熒光定量PCR檢測方法，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR對pCS20基因的最低檢測限分別為17.4和1.74拷貝·μL-1，與牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體和立氏埃立克體等無交叉反應，特異性好。此方法適合大量臨床樣品的檢測，可應用于心水病臨床診斷和疫情監測，為診斷和防控心水病提供技術支持。