丹皮酚對L-精氨酸誘導的小鼠急性胰腺炎氧化損傷的影響

張 鵬，李俞甫，吳尚澤，金圣奇，王家慶，3，Короткова Ирина Павловна，郭文潔*

(1.沈陽工學院生命工程學院，撫順 113122；2.俄羅斯濱海國立農學院，烏蘇里斯克市 692506；3.俄羅斯南烏拉爾國立大學食品技術與生物系，車里雅賓斯克州 454080)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是胰腺的一種外分泌功能障礙，氧化自由基和促炎因子在該病的發生發展過程中扮演著重要的角色[1]，因此，除了抗炎以外，抗氧化也是治療急性胰腺炎的手段之一。目前，已有研究發現，柚皮素通過調節炎癥反應和氧化應激能夠有效保護雨蛙素和L-精氨酸誘導的胰腺炎小鼠[2]，相關研究結果在異甘草素上也得到證實，其主要機制是調控Nrf2/HO-1信號通路[3]。核轉錄因子Nrf2是細胞抗氧化反應的中樞調節者，Nrf2通過與抗氧化原件HO-1相互作用調節抗氧化酶的表達，發揮抗氧化作用[4]。丹皮酚(C9H10O3，paeonol，PAE)是從毛茛科植物牡丹根皮中提取，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及保護神經等藥理作用[5]。丹皮酚及其衍生物的化學結構中具有酚羥基官能團，在抗氧化、去除氧自由基[6]方面效果顯著。因此，本課題組在前期丹皮酚體外抗氧化研究的基礎上，進一步探討其體內抗氧化能力，并深入探究丹皮酚在急性胰腺炎小鼠中的抗氧化機制，希望從分子水平證明丹皮酚的體內抗氧化能力。近年來，盡管急性胰腺炎的相關研究成果頗多，但臨床治療方法及藥物較為單一。因此，研究治療急性胰腺炎的有效藥物對臨床治療此癥具有十分重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆明系雄性小鼠50只，體質量18～22 g，SPF級，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 試劑

丹皮酚(純度>98.5%)和L-精氨酸(純度≥98%)均購自大連美侖生物技術有限公司；血清丙二醛(MDA)檢測試劑盒(A003-1)和總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(A001-3)均購自南京建成生物科技有限公司；MPO一抗、二抗、組化試劑盒、DAB 顯色劑、蘇木素染液、蘇木素分化液等均購自Servicebio公司；Nrf2(稀釋度1∶600)、Keap1(稀釋度1∶600)抗體均購自美國ImmunoWay 生物公司；HO-1(稀釋度1∶600)和β-actin(稀釋度1∶4 000)抗體均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白質檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司。其他常用試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗分組與設計

試驗將小鼠隨機分成5組，每組10只，分別為空白對照組、AP模型組和丹皮酚高、中、低劑量組。按小鼠體重，丹皮酚高、中、低劑量組每組小鼠分別灌胃劑量為100、50、25 mg·kg-1丹皮酚，每天灌胃1次，連續灌胃5 d，每次0.5 mL，同時空白對照組和AP模型組給予等體積生理鹽水。試驗最后一天對高、中、低劑量組小鼠灌胃丹皮酚30 min后，再對AP模型組和丹皮酚高、中、低劑量組小鼠腹腔注射4 g·kg-1的20%L-精氨酸，建立小鼠AP模型。空白對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。6 h后檢測各組小鼠血清中MDA含量和SOD活力。與此同時，取各組小鼠胰腺組織分別用于相關基因、蛋白表達檢測和MPO免疫組化切片制作。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 剖檢肉眼觀察胰腺組織的病理變化 肉眼觀察各組小鼠胰腺組織的病理變化。主要對胰腺的大小、形狀以及顏色變化，胰腺組織有無出血點、出血斑，是否有壞死灶等進行觀察，并用照相機拍照記錄。

1.4.2 胰腺組織MPO免疫組化染色 制作胰腺組織的 MPO 免疫組化切片，觀察胰腺組織中 MPO 的分布及表達。切片、封閉、洗片、一抗孵育、洗片、二抗孵育、洗片、DAB顯色操作后，顯微鏡下觀察，陽性表達產物會被染成棕褐色。比較各試驗組中 MPO的分布及表達。

1.4.3 小鼠氧化指標檢測 按照試劑盒檢測方法，測定各組小鼠血清的MAD含量和SOD活力。

1.4.4 小鼠胰腺組織目的基因mRNA表達量測定 測定小鼠胰腺組織中HO-1、Keap1和Nrf2的mRNA表達量變化。取小鼠胰腺組織制備胰腺組織裂解液，提取胰腺組織總RNA，通過反轉錄，獲得cDNA，以cDNA為模板，采用HO-1、Keap1和Nrf2基因引物(詳見表1)，按照課題組前期摸索的試驗條件，以cDNA模板1 μL，上游和下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用dd H2O補足至20 μL的體系，進行Real-time PCR檢測，并利用2-△△CT方法分析結果。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences used in the real-time PCR

1.4.5 小鼠胰腺組織目的蛋白表達量測定 按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取小鼠胰腺組織總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白樣本，蛋白定量后按照每孔20 μL蛋白上樣液上樣并進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為電壓80 V，恒壓電泳2.5 h，電泳完成后進行轉膜，之后采用5%的脫脂奶粉進行膜的封閉，分別用HO-1、Keap1和Nrf2一抗4 ℃過夜孵育，相應二抗37 ℃孵育45 min。加入ECL進行底物發光后，掃描膠片，分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 試驗數據統計與分析

所有數據需要進行統計學分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對數據進行一維方差分析，經過分析之后的各組試驗數據結果均列入三線表中。

2 結 果

2.1 胰腺組織病理變化觀察

腹腔注射20%L-精氨酸6 h后，各組小鼠胰腺組織病理變化見圖1。圖1B為AP型組，與空白對照組相比，小鼠胰腺組織出現明顯的紅腫、出血、水腫等病理變化。不同劑量丹皮酚組對急性胰腺炎小鼠胰腺組織均有改善作用，其中，中劑量組和高劑量組效果較明顯。

A.空白對照組；B.急性胰腺炎模型組；C.丹皮酚低劑量組；D.丹皮酚中劑量組；E.丹皮酚高劑量組A.Blank control group;B.AP model group;C.Paeonol low-dose group;D.Paeonol medium-dose group;E.Paeonol high-dose group圖1 肉眼觀察小鼠胰腺組織病理變化Fig.1 The pathological changes of pancreatic tissue in mice were observed by naked eyes

2.2 胰腺組織MPO免疫組化染色

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又稱過氧化物酶，是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，存在于中性粒細胞和單核細胞的嗜苯胺藍顆粒中，是髓細胞的特異性標志[7]。為了進一步了解20%L-精氨酸對小鼠胰腺組織造成的損傷程度，考察不同劑量丹皮酚對急性胰腺炎胰腺組織的改善情況，本試驗制作MPO免疫組化切片，觀察MPO的分布及表達。如圖2所示，圖2B為AP模型組，與空白對照組相比，胰腺組織發生嚴重的崩解現象，組織間隙增寬，如箭頭所示出現大量單核細胞、中性粒細胞浸潤，其中，中性粒細胞被染成棕黃色，說明出現明顯的氧化損傷及炎癥反應。不同劑量組丹皮酚有不同程度的MPO分布，隨著劑量的增加，如圖2C～E所示，MPO表達及分布明顯減少。不僅如此，隨著丹皮酚劑量的增加，胰腺組織病理損傷也得到明顯的改善，尤其是高劑量組丹皮酚，接近于空白對照組。

2.3 小鼠血清MDA和SOD檢測

如表2 所示，與空白對照相比，AP模型組MDA含量和SOD活力極顯著上升(P<0.01)，說明小鼠AP模型構建成功。而經過丹皮酚預處理的藥物組與AP模型組相比，丹皮酚不同劑量組小鼠血清MDA含量均極顯著下降且具有劑量依賴性；丹皮酚不同劑量組小鼠血清SOD的活力均極顯著上升且具有劑量依賴性。

表2 丹皮酚對急性胰腺炎小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of paeonol on SOD activity and MDA content in serum of mice with acute pancreatitis

A.空白對照組；B.急性胰腺炎模型組；C.丹皮酚低劑量組；D.丹皮酚中劑量組；E.丹皮酚高劑量組A.Blank control group;B.AP model group;C.Paeonol low-dose group;D.Paeonol medium dose-group;E.Paeonol high-dose group圖2 小鼠胰腺組織MPO免疫組化結果(400×)Fig.2 MPO immunohistochemical results of pancreatic tissue in mice (400×)

2.4 丹皮酚對急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路的影響

2.4.1 丹皮酚對急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路中相關基因表達的影響 采用Real-time PCR檢測小鼠胰腺組織HO-1、Keap1和Nrf2基因mRNA相對表達量，如圖3所示，與空白對照組相比，AP模型組HO-1、Keap1和Nrf2 mRNA表達量極顯著升高。與AP模型組相比，不同劑量丹皮酚組Nrf2 mRNA表達量極顯著升高(P<0.01)，Keap1 mRNA表達量極顯著降低(P<0.01)，中、高劑量丹皮酚組HO-1 mRNA表達量極顯著升高(P<0.01)，低劑量組無顯著變化。

圖3 小鼠胰腺組織HO-1、Keap1以及Nrf2 mRNA表達結果Fig.3 mRNA expression of HO-1,Keap1 and Nrf2 in mouse pancreatic tissue

2.4.2 丹皮酚對急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路中相關蛋白表達的影響 采用Western blot法得到HO-1、Keap1、Nrf2及內參蛋白條帶，如圖4所示，與空白對照組相比，AP模型組HO-1、Keap1和Nrf2蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。與AP模型組相比，不同劑量丹皮酚組HO-1、Nrf2蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)，Keap1蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)。不同劑量丹皮酚組各蛋白表達量呈現劑量依賴關系。

圖4 小鼠胰腺組織HO-1、Keap1以及Nrf2蛋白表達結果Fig.4 Expression of HO-1，Keap1 and Nrf2 protein in mouse pancreatic tissue

3 討 論

小鼠AP模型建立方法有很多，20%L-精氨酸溶液為常見誘導藥物之一，其具有操作簡單、重復性好、對模型動物應激較小等優點，有學者比較牛黃膽酸鈉、雨蛙肽、L-精氨酸誘導急性胰腺炎效果時發現，L-精氨酸誘導AP動物模型更具重復性[8-9]。本課題組前期已完成該模型的建立，試驗證明，20%L-精氨酸誘導的小鼠急性胰腺炎模型具有可重復性、臨床癥狀明顯以及病理變化典型等優點。因此，本研究采用4 g·kg-1的20%L-精氨酸腹腔注射構建小鼠AP模型。在正常情況下，機體處于氧化與抗氧化的動態平衡中，當機體受到外來因素刺激時，往往會打破此平衡。研究發現，劇烈的炎癥反應是引起氧化應激的主要因素之一[10]。因此，本試驗通過構建小鼠AP模型，考察胰腺炎中的氧化應激反應，探究抗氧化在保護胰腺炎中的作用，為急性胰腺炎的發病機制、治療方案以及相關藥物的研發提供理論依據。

臨床調查發現，氧化應激給畜牧業生產帶來極大損害，除造成免疫失敗和誘發家畜傳染病以外，亦會造成奶牛、肉牛、蛋雞和豬生產性能下降，嚴重時會造成動物大面積死亡[11]。當機體抗氧化能力減弱甚至消失時，機體會產生大量自由基，進而發生氧化損傷，自由基的過量產生會導致脂質過氧化，這是細胞損傷的重要原因之一，MDA是脂質過氧化的主要產物[12]。因此，本試驗考察不同劑量丹皮酚對AP小鼠血清MDA含量的影響，從而評估丹皮酚抗氧化能力。SOD 具有專一清除氧自由基的能力，在自由基引起的炎性疾病中發揮著不可替代的作用。據研究報道，SOD 可有效緩解關節炎、急性氣管炎、胸膜炎等炎性疾病中的氧化損傷[13]。因此，本試驗通過檢測各組小鼠血清SOD活力，闡明丹皮酚體內抗氧化能力。

炎性疾病中MPO往往會催化機體各種化學反應，生成過量的氧化劑，造成機體氧化損傷[14]。因此，本文利用MPO免疫組化試驗，考察丹皮酚對MPO表達的影響。為了進一步探究丹皮酚對 20%L-精氨酸誘導的小鼠胰腺氧化應激的保護機制，本試驗對抗氧化相關基因mRNA表達量以及蛋白含量進行了測定。核因子NF-E2相關因子2(Nrf2)是一種重要的氧化還原敏感性轉錄因子，對維持機體抗氧化及防御氧化損傷有重要作用[15]。有研究認為，Nrf2通過與抗氧化元件HO-1相互作用調節抗氧酶的表達發揮抗氧化作用[16]。Song等[17]在研究丹皮酚對載脂蛋白E(ApoE)缺乏小鼠動脈粥樣硬化發展全過程的保護作用時發現，丹皮酚能夠通過提高SOD活性及降低MDA含量進而發揮抗氧化的作用。Li等[18]在探討丹皮酚對結扎性牙周炎大鼠的保護作用時發現，丹皮酚能通過增強Nrf2活性，從而減輕氧化應激反應，以達到有效的保護作用。此外，還有多項研究顯示，丹皮酚可通過激活Nrf2/HO-1通路緩解糖尿病腎纖維化及急性酒精誘發的肝損傷[19-20]。本研究發現，丹皮酚可激活Nrf2/HO-1通路，極顯著升高Nrf2/HO-1，降低Keap1 mRNA和蛋白表達，有效減少胰腺MDA含量及MPO的表達，同時提高SOD活性。

4 結 論

本研究根據課題組前期研究成果，進一步將丹皮酚應用于急性胰腺炎小鼠，探討基于Nrf2/HO-1信號通路下丹皮酚對20%L-精氨酸誘導的小鼠急性胰腺炎氧化損傷的保護作用。研究發現，不同劑量丹皮酚通過激活Nrf2/HO-1信號通路可以有效阻止自身氧化損傷。本試驗結果為臨床急性胰腺炎的治療提供有效替代藥物，同時也為急性胰腺炎發病機制的研究提供新思路。