鴨疫里默氏桿菌MFS外排泵rant基因缺失株的構建及其介導的耐藥性

權 衡，陳啟偉，宮曉煒，王燕萍，秦明星，朱雨佳，鄭福英*，藺國珍*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，R.anatipestifer)是黃桿菌科里默氏菌屬的一種桿狀或橢圓狀、無芽胞、無鞭毛、可形成莢膜的革蘭陰性菌。該菌主要感染1～5周齡的雛鴨，可通過呼吸道、皮膚傷口和消化道等多種途徑導致鴨的急性或慢性敗血癥和漿膜炎。目前公認的鴨疫里默氏桿菌的血清型有21種，我國主要流行的菌株為血清1型、2型和10型。目前鴨疫里默氏桿菌在全國均有流行，血清型也不盡相同，并且不同血清型的菌株之間無交叉保護作用，給疫苗預防增加了很大難度。所以利用抗生素進行預防和治療成為控制鴨疫里默氏桿菌感染和流行的重要手段，同時很大程度上增加了多重耐藥菌株的出現和傳播[1]。

細菌耐藥可分為固有性耐藥和獲得性耐藥兩大類。細菌的耐藥機制有多種，如外排泵的外排、細胞膜通透性的改變、藥物靶點基因的突變、滅活酶、鈍化酶、修飾酶的產生等[2]。外排泵系統是介導細菌固有性和獲得性耐藥的一種主要機制，研究外排泵使我們更加了解轉運蛋白的結構和功能[3]。到目前為止，已經發現了8種與細菌多重耐藥相關的外排泵，其中有近一半屬于普遍存在的ABC和MFS蛋白家族[4-5]。

MFS轉運蛋白家族是目前已知的最大的膜轉運蛋白家族之一，存在于從細菌到植物和哺乳動物的所有門中，其功能與許多生命活動息息相關[6]，通常作為單組分泵，能夠將小溶質通過內膜轉運。MFS轉運蛋白主要作用于糖的吸收，但一些MFS蛋白也參與藥物外排，從而導致細菌產生耐藥性[7]。我們的前期研究發現多株鴨疫里默氏桿菌為多重耐藥菌，對其進行全基因組測序和比較基因組學分析，并應用qPCR、EB外排、CCCP和PAβN外排泵抑制劑等方法進行研究后，發現在鴨疫里默氏桿菌基因組上主要存在MFS、RND和ABC三類外排泵[8]。本試驗研究的Rant蛋白屬于MFS外排泵，rant基因在目前已發表的鴨疫里默氏桿菌基因組序列中高度保守，核苷酸序列相似性為89.24%～100.00%，氨基酸序列相似性為94.07%～100.00%。

rant基因在RA-LZ01株基因組中的編號為GE296_RS02115，位于458 069—459 286 bp，開放讀碼框大小1 218 bp，編碼405個氨基酸，其蛋白分子量大小為44.5 ku。用TMHMM2.0分析其結構，發現Rant蛋白的跨膜螺旋數為12個。依據MFS蛋白序列的水解分析和拓撲學結構預測，幾乎所有的MFS蛋白都具有一個統一的由親水環連接的12個跨膜α螺旋(TMs)組成的拓撲學結構，其N-端和C-端都位于細胞質中[9]。用TMHMM2.0預測出的Rant蛋白的結構符合MFS蛋白的結構特征，支持Rant蛋白屬于MFS家族。

目前關于鴨疫里默氏桿菌MFS外排泵rant基因的功能還未見報道，因此本研究以野生株RA-LZ01作為親本株，構建rant基因缺失株Δrant和回復株cΔrant，對野生株RA-LZ01、缺失株Δrant和回復株cΔrant進行藥敏試驗、測定菌株的生長動態和致病性，研究rant基因在菌株耐藥性、生長和毒力等方面發揮的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和質粒

鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01(GenBank登錄號：NZ_CP045564.1)和LJW-2保存于中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物細菌病創新團隊實驗室；大腸桿菌ATCC25922購自美國菌種保藏中心(American type culture collection)；大腸桿菌X7213和自殺質粒pRE112購自NTCC國家典型培養物保藏中心；穿梭質粒pCPRA由本實驗室構建。

1.2 培養基、試劑及儀器

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自美國DifcoTM公司；2,6-二氨基庚二酸(DAP)購自東京化成工業株式會社；LB肉湯、LB瓊脂、抗生素均購自北京Solarbio公司；DNA Marker、限制性內切酶XbaⅠ、SphⅠ、PstⅠ、T4連接酶、質粒提取試劑盒與膠回收試劑盒均購自TaKaRa(大連)公司；0.22 μm無菌硝酸纖維素濾膜和濾膜裝置購自Millipore公司；紫外分光光度計購于美國 Backman 公司；臺式高速離心機購自Beckman公司；PCR儀購自杭州博日科技公司；酶標儀購自自美國Bio-Rad公司；CO2培養箱購自美國Thermo公司；搖床購自上海蘇坤實業有限公司。

1.3 引物設計

本研究所用的引物的名稱及其對應序列等信息見表1，引物OmpA-F/OmpA-R引用自文獻[10]，其他引物均為本研究中作者設計。引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

表1 PCR引物名稱和序列Table 1 PCR primers and sequences used in this study

1.4 構建基因缺失株Δrant

以親本株RA-LZ01和LJW-2菌株基因組為模板，用引物Up-F/Up-R、Erm-F/Erm-R和Do-F/Do-R分別擴增出rant基因上游同源臂、紅霉素基因ermF和下游同源臂，采用融合PCR將上述DNA片段依次融合，用XbaⅠ和SphⅠ將融合的DNA片段克隆至pRE112載體，轉化于用CaCl2法制備的大腸桿菌X7213感受態細胞中，在含50 mg·L-1氯霉素和50 mg·L-1DAP的LB固體平板篩選。用引物Up-F/Do-R進行PCR驗證，并測序比對。得到重組自殺質粒pRE112-ErmF和陽性供體菌X7213-pRE112-ErmF[10]。

采用結合轉移和同源重組的方法構建基因缺失株[10]。即將供體菌X7213-pRE112-ErmF和受體菌RA-LZ01分別培養至OD600 nm約0.6和1.0。收集菌體后用0.01 mol·L-1的MgSO4溶液洗滌、重懸后混合，用0.22 μm無菌硝酸纖維素膜過濾后將濾膜貼于含有50 mg·L-1DAP的TSA平板，培養24 h，用MgSO4溶液洗下菌苔，在含1 mg·L-1紅霉素、2 mg·L-1多黏菌素B、5%胎牛血清的TSA平板上篩選，用引物OmpA-F/OmpA-R、Rant-F/Rant-R和Erm-F/Erm-R進行PCR驗證。同時用引物Rant-缺失測序-F/Rant-缺失測序-R擴增后進行測序并比對。鑒定合適的菌株命名為Δrant。

1.5 構建基因回復株cΔrant

大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭質粒pCPRA系在前期工作中構建完成[11]。以親本株RA-LZ01為模板，用引物“Co-F/Co-R”擴增出帶有PstⅠ和SphⅠ酶切位點的rant基因，克隆進pCPRA載體，轉化于用CaCl2法制備的大腸桿菌X7213感受態細胞中，在含100 mg·L-1氨芐和50 mg·L-1DAP的LB固體平板上篩選。用引物“Co-F/Co-R”進行PCR擴增并進行測序比對。得到重組穿梭質粒pCPRA-Rant 和陽性供體菌X7213-pCPRA-Rant。同樣利用結合轉移的方法將重組穿梭質粒pCPRA-Rant導入缺失株Δrant中構建回復株[10]。在含有1 mg·L-1頭孢西丁的TSA平板上篩選，用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Rant-F/Rant-R”進行PCR驗證，同時用引物“Rant-回復測序-F/Rant-回復測序-R”擴增后進行測序并比對。鑒定合適的回復株命名為cΔrant。

1.6 構建菌株穩定性測定

缺失株Δrant在含1 mg·L-1紅霉素的TSB中增菌至OD600 nm約1.0，劃線于相同抗性的TSA平板，37 ℃ 5%CO2培養箱培養至長出單菌落，然后隨機挑取單菌落增菌后繼續劃板，用此方法傳30代。用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Erm-F/Erm-R”對第1、5、10、15、20、25、30代的菌液進行PCR以驗證缺失株Δrant的穩定性。用同樣的方法，將回復株cΔrant在含1 mg·L-1頭孢西丁的TSB和TSA平板中傳代，用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Co-F/Co-R”進行PCR以驗證回復株cΔrant的穩定性。用引物“Rant-缺失測序-F/Rant-缺失測序-R”和“Rant-回復測序-F/Rant-回復測序-R”分別擴增第30代缺失株和回復株，測序并比對結果。

1.7 各菌株MIC的測定

用微量肉湯稀釋法測定抗生素對RA-LZ01、Δrant和cΔrant的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)[12-13]。大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株。將抗生素用TSB在96孔板中以2倍連續稀釋，抗生素濃度為0.25～128.00 mg·L-1，同時設置陰性對照(培養基)和陽性對照(菌株)。將菌液增菌至OD600 nm約1.0，用TSB將菌液濃度調整為107CFU (colony-forming unit，CFU)·mL-1，每孔加入100 μL菌液(106CFU)。37 ℃ 5%CO2培養箱中培養24～48 h，在酶標儀中測量其OD600 nm，確定抗生素抑制菌株生長的MIC。此試驗重復3次。

1.8 各菌株生長曲線測定

分別將RA-LZ01、Δrant和cΔrant培養至OD600 nm約1.0，并測定每個菌株的CFU，調整每個菌株的起始濃度均為109CFU·mL-1。以1∶100的比例分別接種至10 mL TSB中，即每個菌株的接種量均為108CFU。37 ℃ 200 r·min-1培養，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計測量其OD600 nm值，共測定12 h。每個菌株做3組平行試驗[14-15]。

1.9 各菌株致病性測定

分別將RA-LZ01、Δrant和cΔrant培養至OD600 nm約1.0，并測定每個菌株的CFU，調整每個菌株的起始濃度均為109CFU·mL-1。將1周齡櫻桃谷鴨隨機分為4組，每組10只，每只腿部肌內注射100 μL菌液(108CFU)。1～3組分別接種RA-LZ01、Δrant和cΔrant，第4組注射生理鹽水作為陰性對照。攻毒后連續觀察14 d制作生存曲線。

2 結 果

2.1 基因缺失株Δrant和基因回復株cΔrant的構建

用引物Up-F/Do-R進行PCR擴增，并對得到的PCR產物進行測序，證實成功構建重組供體菌X7213-pRE112-ErmF。用引物“OmpA-F/OmpA-R”、“Erm-F/Erm-R”和“Rant-F/Rant-R”對基因缺失株Δrant進行PCR鑒定。若ompA和ermF基因擴增出目的條帶，同時rant基因不能擴增出目的條帶，即為Δrant。以引物“Co-F/Co-R”進行PCR擴增并測序鑒定后，證實成功構建重組供體菌X7213-pCPRA-Rant。用引物“OmpA-F/OmpA-R”“Rant-F/Rant-R”進行PCR鑒定回復株cΔrant，若ompA和rant基因均能擴增出目的條帶，即為cΔrant。同時用引物“Rant-缺失測序-F/Rant-缺失測序-R”和引物“Rant-回復測序-F/Rant-回復測序-R”擴增并測序后，證實基因缺失株和基因回復株均構建成功(圖1)。

A.缺失株Δrant的鑒定；B.回復株cΔrant的鑒定；M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.ompA基因的PCR擴增；2.ermF 基因的PCR擴增；3.rant基因的PCR擴增A.Identification of the deletion strain Δrant;B.Identification of the complemented strain cΔrant;M.DL2000 DNA relative molecular mass standard;1.PCR amplification of ompA gene;2.PCR amplification of ermF gene;3.PCR amplification of rant gene圖1 缺失株Δrant和回復株cΔrant的鑒定Fig.1 Identification of the deletion strain Δrant and the reverting strain cΔrant

2.2 所構建菌株的穩定性

穩定性結果顯示，第1、5、10、15、20、25、30代缺失株Δrant均可擴增出ompA和ermF基因(圖2)，回復株cΔrant可擴增出ompA和rant基因(圖3)，測序結果均正確。表明缺失株Δrant和回復株cΔrant均可以穩定傳代。

A.ompA基因的PCR擴增；B.ermF基因的PCR擴增；M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.陽性對照；2～8.第1、5、10、15、20、25、30代菌液；9.陰性對照A.PCR amplification of ompA gene;B.PCR amplification of erythromycin gene;M.DL2000 DNA relative molecular mass standard;1.Positive control;2-8.Amplification from the 1st,5th,10th,15th,20th,25th and 30th generations;9.Negative control圖2 缺失株Δrant穩定性測定Fig.2 Determination of stability of deletion strain Δrant

2.3 各菌株的MIC

測定11類27種抗菌素對野生株、缺失株和回復株的MIC值，結果顯示：與野生株RA-LZ01相比，四環素類抗生素中土霉素、強力霉素和四環素對缺失株Δrant的MIC均減小了75%；與回復株cΔrant相比，土霉素、強力霉素和四環素對Δrant的MIC分別減小了75%、50%和75%。其他類抗生素、去污劑和陽離子染料對3種菌的MIC值均無明顯變化(表2)。結果表明，rant基因介導鴨疫里默氏桿菌對土霉素、強力霉素和四環素的耐藥性。

A.ompA基因的PCR擴增；B.rant基因的PCR擴增；M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.陽性對照；2～8.第1、5、10、15、20、25、30代菌液；9.陰性對照A.PCR amplification of ompA gene;B.PCR amplification of rant gene;M.DL2000 DNA relative molecular mass standard;1.Positive control;2-8.Amplification from the 1st,5th,10th,15th,20th,25th and 30th generations;9.Negative control圖3 回復株cΔrant穩定性測定Fig.3 Stability determination of the complemented strain cΔrant

表2 抗生素對鴨疫里默氏桿菌野生株、缺失株及回復株的MICsTable 2 MICs of antibiotics to R.anatipestifer wild strain,deletion mutant and complemented strain mg·L-1

2.4 各菌株的生長動態

在整個生長周期中，與野生株RA-LZ01相比，缺失株Δrant的生長速率都明顯減慢(P<0.05)。與回復株cΔrant相比，Δrant在第4—9小時的生長速率明顯下降(P<0.05)。回復株cΔrant的生長動態與野生株相比無明顯變化(圖4)。

圖4 野生株、缺失株及回復株生長動態的測定Fig.4 Determination of the growth rates of wild strain,deletion mutant and complemented strain

2.5 各菌株的致病性

與野生株RA-LZ01相比，缺失株Δrant在攻毒后的第5天雛鴨存活率為100%，而野生株RA-LZ01存活率為50%，回復株cΔrant存活率為60%。在攻毒后第10天缺失株Δrant的存活率為70%，野生株RA-LZ01的存活率為10%，回復株Δrant的存活率為30%。這表明rant基因的缺失導致其對雛鴨的致死率顯著降低(圖5)，明顯致弱了野生株RA-LZ01的毒力。當rant基因回復后，回復株cΔrant的毒力也相應得到部分回復。

圖5 鴨疫里默氏桿菌野生株RA-LZ01、缺失株Δrant和回復株cΔrant感染鴨的毒力試驗Fig.5 The virulence experiment of R.anatipestifer wild strain RA-LZ01,deletion mutant Δrant and complemented strain cΔrant infecting ducklings

3 討 論

鴨疫里默氏桿菌屬于黃桿菌科，里默氏菌屬，可感染鴨、鵝、雞、火雞等多種家禽，其發病鴨死亡率可高達75%，是危害養鴨業最嚴重的致病菌之一，給養鴨業造成嚴重經濟損失。并且不同血清型之間沒有交叉保護給疫苗預防增加了很大難度[16-17]。在實際生產中使用抗生素預防和治療鴨疫里默氏桿菌感染是一個有效的防控手段，與此同時也導致細菌耐藥性上升，多重耐藥菌株不斷出現和傳播，給鴨疫里默氏桿菌病的防控帶來巨大挑戰。基于此，研究鴨疫里默氏桿菌的耐藥機制對于控制耐藥菌株的產生和傳播，提高現有抗生素的應用效果，以及開發針對性更強的新型抗生素均具有重要意義[18]。

自MFS家族確立以來，家族成員被迅速擴大，目前由74個家族成員組成。MFS中眾所周知的多重藥物轉運蛋白成員包括大腸桿菌的QacA，ErmAB-TolC系統的ErmB、ErmD、MdfA以及乳酸乳球菌的LmrP[9]。研究表明大腸桿菌MdfA是質子電化學梯度驅動的藥物/質子反向轉運體，同時發現MdfA在弗氏志賀菌、腸炎傷寒沙門菌和鼠疫耶爾森菌中具有同源序列。乳酸乳球菌的多重耐藥轉運蛋白LmrP可以利用膜電位和化學質子梯度的質子動力來介導兩性底物排出細胞。MFS泵屬于最大的繼發性膜轉運蛋白，是轉運糖類、中間代謝產物和藥物必不可少的系統。在MFS家族中研究最多的泵是金黃色葡萄球菌的NorA，枯草芽胞桿菌的同源物Bmr、Blt、Tet和MdfA[9]。

目前已經報道了幾種介導鴨疫里默氏桿菌耐藥的基因和外排泵，如鴨疫里默氏桿菌CH-1株中B739_0873基因的缺失導致其對氨基糖苷類和去污劑的敏感性增加[19]；RA-GD菌株中的ABC外排泵RanB介導其對有機溶劑的外排[10]，RND外排泵RaeE-RaeF-RopN介導其對氨基糖苷類抗生素和去污劑SDS的抗性[16]；CH3株中M949_0459基因的缺失導致其對替加環素敏感性增加[20]；Zhu等[21]從212株鴨疫里默氏桿菌中發現tet(A)、tet(B)、tet(M)、tet(O)、tet(O/W/32/O)、tet(Q)和tet(X)基因都參與了四環素類抗生素的耐藥等。本研究的藥敏試驗結果顯示，鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01為1株多重耐藥菌株。當將rant基因缺失后菌株對四環素類抗生素的敏感性明顯增加，而當rant基因回補后菌株對四環素類抗生素的抗性得到了完全或部分回復。

一些研究發現，多藥外排泵除了介導細菌對抗生素的抗性，還與細菌的多種表型有關，其中包括細菌的生長和毒力，例如肺炎克雷伯菌中的AcrB[22]、腸炎沙門菌外排泵系統macAB[23]、結核分枝桿菌中的MmpL11[24]和鼠傷寒沙門菌中的AcrA[25]和AcrB[26]。本研究也發現，rant基因缺失后鴨疫里默氏桿菌的生長速率降低，說明rant基因參與菌株的生長。

近年來報道了幾個與鴨疫里默氏桿菌毒力相關的基因，例如CH3株的鐵離子利用相關基因tonB[27]和LPS合成相關基因M949_RS01915[28]；血清2型Th4株的OmpA基因[29]；CH-1菌株的莢膜合成相關基因wza[30]；Yb2 株的調控相關基因luxE(AS87_03730)[31]。研究發現上述基因缺失后菌株毒力有明顯的下降。Li等[10]報道當將鴨疫里默氏桿菌RA-GD菌株ABC外排泵基因RIA_1614缺失后毒力下降了43倍(原文獻表述)。本文中rant基因缺失后導致菌株對鴨的感染力下降，特別是感染急性期鴨的發病率和死亡率均顯著降低，而當rant基因回補后菌株毒力有明顯回復。這些結果說明rant基因與鴨疫里默氏桿菌的毒力相關，但該基因滅活導致菌株毒力下降的機制可能比較復雜，需進行深入研究。

4 結 論

成功構建鴨疫里默氏桿菌rant基因缺失株Δrant和基因回復株cΔrant。通過基因功能驗證，發現rant基因介導鴨疫里默氏桿菌對四環素類抗生素的耐藥性，也與菌株的生長和毒力有一定的相關性。