禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定

郭瑞珍，蘇冰倩，王 棋，王 一，于朋偉，孟潔潔，齊艷麗，楊國宇，褚貝貝

(河南農業大學 農業部動物生化與營養重點開放實驗室，鄭州 450002)

禽腺病毒 (fowl adenovirus,FAdV)屬于腺病毒科Adenovirudae，是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒[1]，根據分子生物學標準可將FAdV屬分成A～E 5個群，每個群內的病毒株依據血清交叉中和試驗又進一步分為不同的血清型[2]。流行病學研究表明，雞群主要FAdV流行毒株為高致病性血清4型禽腺病毒 (fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)，可引起一種高度傳染性雞肝炎心包積液綜合征[3](hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)，該病毒呈世界性分布，危害嚴重[4]。自2015年以來，由FAdV-4引起的HHS不僅發生于3～4周齡肉雞，還發生于10～20周齡蛋雞[5]，主要以垂直傳播方式傳給下一代，也可通過糞口途徑進行水平傳播，死亡率高達80%，給國內養雞業造成了嚴重的經濟損失[6]。此外，測序分析顯示，與其他國家和地區的FAdV-4分離株相比，國內近期的FAdV-4分離株具有獨特的突變，其基因組存在明顯的缺失[7]。然而，關于FAdV-4的感染和發病機制的分子機制卻知之甚少，且對全球家禽業造成了嚴重的影響。

FAdV-4的核衣殼由五鄰體 (penton)、六鄰體 (hexon)和纖突蛋白 (Fiber)等主要結構蛋白構成[8-9]。Fiber蛋白分為一條長纖維 (Fiber 1)和一條短纖維 (Fiber 2)，其中Fiber 2蛋白可通過識別宿主細胞上的特異受體而幫助病毒吸附結合在宿主細胞上，在病毒增殖或組裝的某些過程中是必需的[10]。此外，Fiber2蛋白還具有型和亞群特異性抗原決定簇，可誘導機體產生主要的型特異性中和抗體[11]。因此，Fiber2對FAdV-4的感染、致病及診斷有重要意義[12]。國內流行的FAdV-4基因型與國外早期的FAdV-4株相比，Fiber2基因發生了較大的變異[13]。流行病學調查顯示，相同血清型的不同FAdV株的致病性也存在很大差異[14]。因此，推測FAdV-4在傳播過程中的變異導致毒力的變化。此外，有研究表明，Fiber2基因在FAdV-4毒力中起關鍵作用[14-16]，所以，有必要對其進行分析。目前，國內研究表達的Fiber2蛋白多為包涵體，而且缺乏相關Fiber2單抗的研究[17]。由于缺乏針對FAdV-4纖維蛋白的單克隆抗體 (MAb)，此類研究的進展受到嚴重限制。因此，本研究以國內的1株FAdV-4的Fiber2基因為模板，通過對Fiber2基因密碼子優化后進行原核表達，獲得可溶性蛋白，并免疫小鼠，制備了一種新的針對Fiber2蛋白的單克隆抗體 (命名為MAb 2G5)，并對其表位進行了鑒定。MAb 2G5進行純化，經檢測發現具有良好的反應性和特異性，為研發FAdV-4相關的診斷試劑及疫苗提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

FAdV-4 (分離自河南某養雞場)、SP2/0骨髓瘤細胞 (ATCC)、雞肝癌細胞 (LMH,ATCC)。FAdV-4Fiber2基因由上海金斯瑞生物科技有限公司進行密碼子優化并合成。帶有不同促溶標簽的原核表達載體pET21b-His6-Grifin-TEV (276-2)、pET21b-His6-GST-TEV (276-3)、pET21b-His6-NusA-TEV (276-5)、pET21b-His6-SUMO-TEV (276-6)、pET21b-His6-Thioredoxin-TEV (276-7)、pET21b-His6-ArsC-TEV (276-9)、pET21b-His6-γ-crystallin-TEV (276-16)、pET21b-His6-PpiB-TEV (276-21)以及大腸桿菌BL21感受態細胞均由本實驗室保存。表達FAdV-4 Fiber2的pCAGGS-HA-Fiber2真核表達質粒為本實驗室構建、保存。6～8周齡的雌性SPF級BALB/c小鼠購自鄭州大學中心實驗室。Ni-NTA Agarose購自QIAGEN；雜交瘤細胞無血清培養基Ⅲ購自上海源培生物有限公司；小鼠抗His單抗購自中杉金橋公司；AEC酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋；FITC標記的山羊抗小鼠IgG以及HAT、HT貯存液、融合劑PEG1450均購自Sigma公司；DAPI染色試劑購自Servicebio (G1012)；小鼠IgG干粉購自Solarbio；小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自Sino Biological；Protein G Resin購自TRAN；HRP-偶聯試劑盒 (過碘鹽酸法)購自酶免生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質粒的構建及驗證 基于FAdV-4纖突蛋白Fiber2基因序列，引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，對序列中大腸桿菌稀有密碼子進行分析，然后由金斯瑞生物科技有限公司進行優化合成，再亞克隆到帶有不同促溶標簽的原核表達載體上，經過酶切鑒定，得到帶有不同促溶標簽的Fiber2重組質粒。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達和可溶性分析 通過熱激法將鑒定正確的不同重組質粒轉化至表達菌株BL21中進行誘導表達，挑取單克隆菌株，在37 ℃、220 r·min-1下振蕩培養至OD600 nm為0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG于18 ℃、180 r·min-1誘導12 h，收集菌體進行超聲破碎，10 000 r·min-1離心10 min后收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE電泳后利用考馬斯亮藍染色檢測重組蛋白的表達量及可溶性。

1.2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定 選取可溶性最好的重組蛋白NusA-Fiber2，按照“1.2.2”中方法大量誘導表達，參照QIAGEN生物科技有限公司Ni-NTA Agarose操作技術手冊純化Fiber2蛋白，同時以此方法純化促溶標簽NusA蛋白，通過SDS-PAGE電泳后檢測蛋白純度。利用聚氰基丙烯酸正丁酯法(bicinchoninic acid,BCA)測定純化的蛋白濃度，定量至1 mg·mL-1后于-80 ℃ 保存。純化后的NusA-Fiber2蛋白和NusA蛋白經SDS-PAGE電泳后濕轉印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)，室溫條件下，用5%脫脂奶封閉2 h，再分別以His單抗(1∶1 000 稀釋)和FAdV-4鼠源多克隆血清 (1∶1 000稀釋)為一抗，于4 ℃孵育12 h，TBST (0.1% Tween-20 phosphate buffer saline)洗3遍。二抗為HRP標記的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀釋)，室溫條件下孵育1 h；TBST洗滌3次，顯影曝光分析純化的Fiber2蛋白的免疫原性。

1.2.4 間接ELISA檢測方法的建立 采用方陣滴定法確定抗原 (NusA-Fiber2蛋白)最佳包被濃度和陽性血清的最佳稀釋度，HRP標記的山羊抗小鼠IgG作1∶5 000稀釋。其他步驟按照常規ELISA程序[12,17-19]，以此確定抗原最佳包被濃度和血清最適稀釋度。

1.2.5 免疫過氧化物酶單層細胞試驗(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA) 將LMH細胞接種于96孔細胞培養板，待形成約90%細胞單層時，FAdV-4以MOI等于0.01接種細胞，置于37 ℃細胞培養箱中培養24 h,用含3% H2O2甲醇固定，該板可立即使用也可凍存于-40 ℃備用，用封閉液于37 ℃封閉1 h，PBST洗1次，加入一抗，同時設置不接種病毒的陰性對照和不加一抗的空白對照，37 ℃孵育1.5 h，PBST洗4次，加入酶標二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗4次，加入AEC顯色液，室溫避光作用10 min后，于倒置顯微鏡下觀察結果，陰性對照和空白對照均無著色，細胞特異性染色成紅棕色即為陽性，否則為陰性。

1.2.6 小鼠免疫 將純化的NusA-Fiber2蛋白按100 μg·只-1的劑量與弗氏佐劑1∶1乳化后免疫6周齡BALB/c雌鼠，第3次免疫后，對免疫小鼠進行尾靜脈采血，用已建立的間接ELISA方法和 IPMA方法鑒定其抗體分泌水平，抗體水平高的小鼠加強沖擊1次。

1.2.7 細胞融合及陽性雜交瘤細胞篩選 取加強免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞進行融合。用間接ELISA及IPMA法篩選分泌抗FAdV-4 Fiber2抗體的陽性雜交瘤細胞，對篩選出的陽性雜交瘤細胞采用有限稀釋法進行4次亞克隆以建立穩定細胞株。雜交瘤細胞建株后進行擴大培養、凍存保種。

1.2.8 腹水的制備、MAb的純化和標記 向12周齡的BALB/c雌鼠腹腔注射0.3 mL不完全弗氏佐劑，1周后，取2×106～5×106個對數増殖期的單克隆細胞2G5進行腹腔注射，當小鼠腹腔明顯脹大時，使用注射器收集腹水。收獲的腹水用Protein G柱子進行純化，參照Protein G柱子說明書進行。純化后的腹水通過SDS-PAGE分析，經考馬斯亮藍染色鑒定其純度。通過BCA法測定純化的抗體濃度后，使用HRP-偶聯試劑盒 (過碘鹽酸法)對抗體進行HRP標記。

1.2.9 單克隆抗體生物學特性分析 單克隆細胞染色體數目分析：取對數增殖期的單克隆細胞以及SP2/0細胞，加入0.3 mg·mL-1的秋水仙素液，37 ℃培養6 h后收集細胞，低滲處理、固定、制片、吉姆薩染色、脫色、鏡檢并拍照，最后進行染色體計數并分析。單克隆細胞分泌抗體的穩定性分析：將雜交瘤細胞連續傳代培養3個月，用“1.2.4”建立的間接ELISA方法和“1.2.5”中IPMA法檢測細胞培養液中的抗體分泌水平，分析雜交瘤細胞分泌抗體的穩定性；MAb的腹水效價測定及亞類鑒定：將“1.2.8”中純化的腹水進行2倍倍比稀釋，按照“1.2.4”建立的間接ELISA方法和“1.2.5”中IPMA檢測方法進行效價測定。同時采用Sino Biological小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒進行抗體亞類鑒定。

1.2.10 單克隆抗體的間接免疫熒光 (IFA)檢測 將雞肝癌細胞LMH鋪于24孔板，待LMH單層生長至80%～90%后，用MOI為0.01 的FAdV-4進行感染，同時設立正常細胞為陰性對照。感染24 h后，棄上清液，用預冷的4%多聚甲醛于室溫下固定細胞20 min，PBS洗滌3次；用0.1%TritonX-100于室溫通透細胞膜10 min，PBS洗滌3次；使用含10%胎牛血清的PBS于室溫下封閉1 h，PBS洗滌3次；將適當稀釋的小鼠IgG (mouse IgG)和制備的Fiber2單克隆抗體 (mAb 2G5)與固定的細胞于37 ℃共孵育1 h，PBS洗滌3次，加入稀釋后的FITC標記的山羊抗小鼠IgG (1∶1 000)，于37 ℃避光孵育1 h后，PBS洗3次；加入DAPI染色試劑于室溫避光孵育10 min，PBS洗滌3次、雙蒸水洗滌3次；加入封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察、分析并采集圖像。

1.2.11 單克隆抗體的Western blot鑒定 用MOI為0.01的FAdV-4感染LMH細胞，或轉染pCAGGS-HA-Fiber2質粒的LMH細胞，收取細胞蛋白后，經SDS-PAGE 電泳后濕轉印至聚偏二氟乙烯膜 (polyvinylidene fluoride，PVDF)，室溫條件下，用5%脫脂奶封閉2 h，PBST洗滌3次后，加入制備的Fiber2單克隆抗體 (1∶1 000稀釋)于4 ℃孵育12 h；PBST洗滌3次后，加入HRP標記的山羊抗鼠IgG (用5%脫脂奶按1∶5 000稀釋)；PBST洗滌3次后，顯影曝光并分析試驗結果。

1.2.12 單克隆抗體的體外中和試驗 在96孔板內，將系列稀釋的MAb 2G5 50 μL與MOI等于0.001的FAdV-4病毒液等體積混勻，放置37 ℃、5%CO2培養箱孵育1 h。隨后接種LMH細胞，100 μL·孔-1，同時設置Mouse IgG 陰性對照和LMH細胞空白對照，37 ℃孵育2 h后，用PBS洗滌1次，隨即加入含1%胎牛血清的DME/F-12培養基進行培養，3 d后在倒置顯微鏡下觀察病毒的復制情況。

1.2.14 抗原表位篩選 為篩選出MAb 2G5所識別的抗原表位，首先將Fiber2蛋白截為兩段，命名為N1、C2，根據Fiber2蛋白的基因序列設計合成引物，并以其為模板進行PCR擴增，PCR產物N1、C2部分重疊，將其分別克隆于pCAGGS-HA載體中，將構建的兩個重組質粒轉染LMH細胞后分別以MAb Flag (1∶800)和純化的MAb 2G5 (1∶1 000)作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG (1∶5 000)為二抗對獲得的MAb 2G5進行Western blot鑒定，初步確定MAb 2G5所識別的抗原區域，根據鑒定結果，再將N1的基因片段從5′端采用逐步截短法分成N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11和N12，以上述Western blot方法進一步鑒定MAb 2G5識別的抗原表位區域。

2 結 果

2.1 重組質粒的雙酶切鑒定

將公司合成大腸桿菌偏好密碼子的Fiber2基因序列 (1 440 bp)及帶有不同促溶標簽的表達載體進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，使用T4連接酶連接雙酶切產物。提取重組質粒后進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證，酶切結果與預期大小相符，重組質粒命名為276-2-Fiber2、276-3-Fiber2、276-5-Fiber2、276-6-Fiber2、276-7-Fiber2、276-9-Fiber2、276-16-Fiber2、276-21-Fiber2 (圖1)。

A.載體BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；B.目的片段BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；C.重組質粒酶切鑒定；M.DL5000 DNA相對分子質量標準;1～8.276-2、276-3、276-5、276-6、276-7、276-9、276-16、276-21雙酶切片段；9.FAdV-4 Fiber2雙酶切片段(1 440 bp)；10～17.Grifin-Fiber2、GST-Fiber2、NusA-Fiber2、SUMO-Fiber2、Thioredoxin-Fiber2、ArsC-Fiber2、γ-crystallin-Fiber2、PpiB-Fiber2A.Restriction enzyme digestion of vectors;B.Restriction enzyme digestion of target fragment;C.Restriction enzyme digestion of recombinant plasmids;M.DL5000 DNA marker;1-8.276-2,276-3,276-5,276-6,276-7,276-9,276-16,276-21;9.FAdV-4 Fiber2 (1 440 bp);10-17.Grifin-Fiber2,GST-Fiber2,NusA-Fiber2,SUMO-Fiber2,Thioredoxin-Fiber2,ArsC-Fiber2,γ-crystallin-Fiber2,PpiB-Fiber2圖1 載體、目的片段雙酶切及重組質粒酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion of vectors and target fragment and restriction enzyme digestion of recombinant plasmids

2.2 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析

將鑒定正確的重組質粒轉入表達菌株BL21中進行誘導表達，SDS-PAGE電泳分析表達蛋白，如圖2所示，帶有不同促溶標簽的重組蛋白經誘導后均出現預期大小的目的蛋白，其中重組蛋白Grifin-Fiber2、GST-Fiber2、NusA-Fiber2、SUMO-Fiber2、ArsC-Fiber2、γ-crystallin-Fiber2、PpiB-Fiber2表達產物以可溶性的形式存在于上清液中，重組蛋白Thioredoxin-Fiber2表達產物以包涵體的形式存在于沉淀中。綜合結果，選取可溶性最好的NusA-Fiber2進行后續研究。

圖2 重組蛋白的可溶性分析Fig.2 The solubility analysis of the recombinant protein

2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定

誘導表達的重組蛋白NusA-Fiber2及標簽蛋白NusA使用Ni-NTA Agarose純化，如圖3A、B所示，以不同濃度咪唑洗脫，摸索蛋白純化最佳條件，各步驟樣品分別做SDS-PAGE電泳分析，NusA蛋白和NusA-Fiber2蛋白的咪唑洗脫緩沖液濃度分別為100、500 mmol·L-1，純化后的蛋白用BCA法測定蛋白濃度分別為1.125、2.364 mg·mL-1，均定量為1 mg·mL-1后保存于-80 ℃備用。將純化的NusA-Fiber2及NusA蛋白進行Western blot鑒定，如圖4A、B所示，純化的NusA-Fiber2蛋白和NusA蛋白均能與His單克隆抗體特異性結合，但只有NusA-Fiber2蛋白能與FAdV-4鼠源多克隆血清特異性結合。

A.標簽蛋白NusA純化結果；B.重組蛋白NusA-Fiber2純化結果；M.PageRuler預染蛋白相對分子質量標準A.Purification results of label protein NusA;B.Purification of recombinant NusA-Fiber2;M.PageRuler prestaining protein marker圖3 蛋白純化結果Fig.3 Protein purification results

A.His單克隆抗體；B.FAdV-4鼠源多克隆血清；M.PageRuler預染蛋白相對分子質量標準A.His monoclonal antibody;B.Mouse polyclonal serum to FADV-4;M.PageRuler prestaining protein marker圖4 Western blot鑒定結果Fig.4 Identification of Western blot of NusA and NusA-Fiber2

2.4 間接ELISA方法的建立

NusA-Fiber2蛋白稀釋濃度為100 ng·μL-1，4 ℃ 過夜或37 ℃ 2 h；封閉條件：5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；待檢血清稀釋度為1∶640，37 ℃孵育1.5 h；酶標二抗山羊抗小鼠IgG的稀釋度為1∶5 000，37 ℃孵育1 h。陽性判斷標準為待檢血清OD450 nm大于0.234，小于0.234為陰性。

2.5 間接ELISA、IPMA檢測免疫小鼠血清中fiber2抗體

將免疫3周后的小鼠經尾靜脈取血后進行間接ELISA方法、IPMA方法檢測其抗體分泌水平，如圖5A所示ELISA檢測結果，2只免疫后小鼠血清中Fiber2抗體分泌水平均較高，且血清稀釋1 280 倍后仍可以檢測到Fiber2抗體，但免疫小鼠血清不與標簽蛋白NusA發生特異性反應；IPMA檢測結果如圖5B所示，經AEC顯色后，免疫后小鼠血清稀釋1280倍后，同樣可與FAdV-4發生特異性反應，而對照小鼠血清不與FAdV-4發生特異性反應。

A.間接ELISA檢測免疫3周后Fiber2抗體分泌水平；B.IPMA檢測免疫3周后Fiber2抗體分泌水平A.Indirect ELISA was used to detect Fiber2 antibody secretion 3 weeks after immunization;B.IPMA was used to detect Fiber2 antibody secretion 3 weeks after immunization圖5 間接ELISA、IPMA檢測免疫小鼠血清中fiber2抗體Fig.5 Fiber2 antibody in serum of immunized mice was detected by indirect ELISA and IPMA

2.6 雜交瘤細胞株的篩選

取加強免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合，通過間接ELISA檢測獲得7株陽性雜交瘤細胞 (圖6)，4次亞克隆后，通過IPMA檢測，挑選出3株能穩定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的雜交瘤細胞株，分別命名為2G5、2G8、4C2 (圖7)。

圖6 間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞株Fig.6 Indirect ELISA was used to screen positive hybridomas

挑選出3株陽性雜交瘤細胞株2G5、2G8、4C2 (38-3為本實驗室制備的PRV N蛋白單克隆抗體，其與陰性對照一樣均不能與FAdV-4有特異性反應)Three positive hybridomas 2G5,2G8 and 4C2 were selected (38-3 was monoclonal antibody of PRV N protein purified in our laboratory,which,like the negative control,cannot react specifically with FAdV-4)圖7 雜交瘤細胞的IPMA篩選Fig 7 Screening of hybridomas by IPMA

2.7 抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體的獲得

對MAb 2G5腹水進行純化，SDS-PAGE電泳分析表明，純化后的單克隆抗體可見1條大小為55 ku的重鏈，以及1條大小為25 ku輕鏈，而未見其他雜帶 (圖8)。

圖8 SDS-PAGE電泳分析純化的2G5Fig.8 SDA-PAGE analysis of the purified 2G5

2.8 單克隆抗體生物學特性分析

對所獲得的50個2G5、50個2G8以及50個4C2陽性雜交瘤細胞的染色體數目進行計數，平均為104條，是兩種親本細胞的染色體數目之和，染色體核型主要為端著絲粒，少數為中著絲粒(圖9A)。

通過IPMA檢測雜交瘤細胞分泌抗體的穩定性，結果顯示，3株單克隆細胞株均能穩定的分泌抗Fiber2抗體 (圖9B)。利用試劑盒進行亞型檢測發現，2G5、2G8、4C2均為典型IgG 1型抗體 (圖9C)。制備的MAb 2G5，用間接ELISA方法和IPMA方法進行效價測定，其效價分別大于1∶220和1∶218。

A.雜交瘤細胞染色體數目檢測；B.雜交瘤細胞株分泌Fiber2抗體的穩定性檢測；C.單克隆抗體亞型鑒定A.Check the number of chromosomes in the hybridoma cells;B.The stability of the secretion of Fiber2 antibody by hybrid tumor cell lines was determined;C.Identification of monoclonal antibody subtypes圖9 單克隆抗體生物學分析Fig.9 Biological analysis of monoclonal antibodies

2.9 抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體特異性分析

為進一步驗證獲得的MAb 2G5的特異性，對感染FAdV-4的雞肝細胞進行IFA及Western blot分析。檢測結果顯示，MAb 2G5與感染FAdV-4的雞肝細胞呈現出特異性免疫反應，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而Mouse IgG不與感染FAdV-4的雞肝細胞呈現出特異性免疫反應 (圖10A)，Western blot檢測結果顯示MAb 2G5能特異性檢測到FAdV-4(圖10B、C)。結果表明，獲得的MAb 2G5具有針對FAdV-4 Fiber2的良好特異性，并且是具有良好IFA和Western blot反應原性的單克隆抗體，為研制針對FAdV-4的快速血清學診斷方法提供一定的試驗數據。

2.10 單克隆抗體的體外中和試驗

由于Fiber2蛋白位于FAdV-4病毒表面，可能在介導病毒感染中發揮重要作用。在中和試驗中，通過顯微鏡觀察病變孔，檢測到MAb 2G5最高可在1∶ 50稀釋條件下有效阻斷FAdV-4感染。而在小鼠IgG處理或不進行任何抗體處理的FAdV-4感染細胞中可以看到明顯的病毒蝕斑。

2.11 雙抗體夾心法ELISA分析

捕獲抗體與檢測抗體進行交叉配對試驗，選擇OD450 nm平均值最高的一組作為夾心ELISA抗體組合。根據試驗結果，選取4C2作為捕獲抗體，最佳工作濃度為5 μg·mL-1，酶標抗體2G5-HRP作為檢測抗體，最佳稀釋比為1∶1 000。通過計算，得出20份SPF雞的泄殖腔棉拭子樣品的平均值為0.13，標準差為0.014。因此，確定該方法的臨界值為0.172。利用已建立好的夾心ELISA方法檢測IBDV的NF8株以及B87株弱毒疫苗，NDV的LaSota株、Clone30株以及CS2株感染的細胞上清均無交叉反應，可知該方法特異性良好 (圖10)。該方法對Fiber2蛋白的最低檢出濃度為0.039 μg，對FAdV-4的最低檢出量為104個TCID50。該方法的批間、批內的變異系數(CV)均小于10%，證明本試驗建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法具有良好的重復性。

2.12 MAb 2G5的抗原表位鑒定

將FAdV-4 Fiber2蛋白以及各截短質粒轉染到LMH細胞中后，Western blot結果顯示MAb 2G5僅與N端的片段N1 (aa1—286)發生特異性結合，不與C端的片段C2 (aa233—480)發生特異性結合；再將N1片段從5′端采用二分之一截短法分成N3 (aa1—150)、N4 (aa124—286)、N5 (aa1—92)、N6 (aa75—150)、N7 (aa1—58)、N8 (aa41—92)、N9 (aa1—39)、N10 (aa22—58)、N11 (aa1—33)和N12 (aa16—39)，結果顯示，MAb 2G5能夠與N3、N5、N7、N9、N11片段發生特異性反應，而均不與N4、N6、N8、N10、N12片段發生特異性反應 (圖10)，表明MAb 2G5識別的氨基酸序列范圍是N端aa1-aa33：1MLRAPKRRHSENGKPETEAGPSPAP IKRAKRMV33。

A.IFA檢測單克隆抗體特異性；B.感染FAdV-4 (MOI=0.01)的LMH細胞后Western blot鑒定MAb 2G5特異性；C.轉染pCAGGS-HA-Fiber2質粒的LMH細胞后Western blot鑒定MAb 2G5特異性A.IFA identifies the specificity of monoclonal antibodies;B.The specificity of MAb 2G5 was determined by Western blot after infected with FAdV-4 at an MOI of 0.01;C.The specificity of MAb 2G5 was determined by Western blot after transfection of LMH cells with pCAGGS-HA-Fiber2 plasmid圖10 單克隆抗體的特異性檢測Fig.10 Test the specificity of monoclonal antibodies

圖11 交叉反應性試驗Fig.11 Cross reaction assay

3 討 論

自2015年6月起，HHS在全國范圍內開始暴發。Niu等[14]對我國2015—2016年期間分離出的105株FAdV進行序列分析發現，其中93%為FAdV-4，說明FAdV-4是引起我國HHS的主要病原。2015年，對河南地區12個規模化養殖場40份疑似HHS感染的組織進行病原檢測，FAdV-4陽性率高達87.5%[20]。目前國內對于FAdV-4的研究多集中于病毒的分離鑒定及生物學特性研究，對其蛋白的結構與功能的研究多集中于Hexon[21]。Fiber2作為FAdV-4的結構蛋白，其抗原表位具有主要的型特異性和亞屬特異性，能有效刺激中和抗體產生[22]。Zhang等[21]最近報道，Fiber2是中國高致病性流行FAdV-4毒力的關鍵毒力因子。Schachner等[23]之前的一份報告表明，Fiber2可以對FAdV-4的高致病性感染提供有效的保護。劉超等[16]為了研究Fiber2蛋白免疫保護性，原核表達了FAdV-4 Fiber2和鼠傷寒沙門菌 (Salmonellaty phimurium)鞭毛的融合蛋白，Western blot試驗表明重組蛋白能與FAdV-4陽性血清發生特異性反應，具有良好反應原性。

國內文獻報道的Fiber2表達蛋白多為包涵體[17]，在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象，在進行純化時需要經過變性與復性后才能變成具有一定活性的蛋白，且純化操作繁瑣。獲得可溶性的Fiber2蛋白會增加蛋白的生物學活性，有利于FAdV-4的檢測和FAdV-4疫苗的研發[10,23-28]。本試驗構建了帶有不同促溶標簽的原核表達載體，通過低溫誘導大大降低蛋白錯誤折疊的概率，提高了蛋白的可溶性表達效率，利用鎳柱進行純化，得到大量且純度較高的具有生物學活性的Fiber2蛋白，制備了針對該單抗的MAb，并初步建立了具有較好特異性、敏感性和重復性的雙抗體夾心ELISA檢測方法，為FAdV-4的臨床診斷提供了檢測工具。

圖12 MAb 2G5對FAdV-4識別抗原表位的鑒定Fig.12 Identification of FAdV-4 antigenic epitopes by MAb 2G5

本試驗中通過構建截短的Fiber2真核表達載體，鑒定出MAb 2G5識別的表位位于FAdV-4的Fiber2蛋白N端aa1—33之間。通過中和試驗，檢測到該抗體具有一定的中和活性。Wang等[11]制備的針對Fiber2蛋白的MAb 3C2識別的表位可能是構象表位，進一步研究中發現MAb 3C2識別的是具有較高中和活性的表位，位于FAdV-4的Fiber2蛋白aa416—448之間。在本研究中，制備的MAb 2G5能與Fiber2原核表達蛋白特異性反應，說明該蛋白至少有一個能被該抗體試體識別的線性表位[29-31]。同時，利用IFA和Western blot方法均可檢測到MAb 2G5與FAdV-4特異性反應，證明該抗體既針對Fiber2蛋白的線性表位又針對其構象表位，可用于IFA和Western blot研究Fiber2在雞細胞中的分布定位、表達變化等，為進一步研究Fiber2在禽疫病發病機制中的作用提供了一定基礎。本研究鑒定出該單抗的表位，也為針對FAdV-4的表位疫苗的研制提供了基礎。

4 結 論

本研究成功制備了可溶性的FAdV-4 Fiber2蛋白，且制備的MAb 2G5具有良好IFA和Western blot反應原性，同時具有一定的中和活性。初步建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，該方法具有較好特異性、敏感性和重復性，可以用于FAdV-4的檢測。成功篩選出MAb 2G5在FAdV-4 Fiber2上的抗原表位識別區域：aa1—33，為進一步研究Fiber2在禽疫病發病機制中的作用提供了一定基礎，也為針對FAdV-4的表位疫苗的研制提供了基礎。