民豬脂肪細胞分化過程中抗寒相關基因表達規律研究

范文博，馬 紅，馬守正，汪 亮，劉 娣,*

(1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150036；2.黑龍江省農業科學院畜牧研究所，哈爾濱 150000)

民豬具有抗寒、產仔多、肉質好、耐粗飼等突出優點。民豬的抗寒能力是它能在東北地區生存的關鍵因素，而脂肪是民豬抗寒的主要組織。脂肪組織主要分為3種類型：白色脂肪、棕色脂肪及米色脂肪。白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)的主要功能是以三酰基甘油(triacylglycerol，TAG)的形式存儲多余的能量；棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)是哺乳動物體內非顫抖性產熱的主要器官，通過解偶聯蛋白 1(uncoupling protein，UCP1)介導的氧化磷酸化與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成的解偶聯作為熱量來耗散能量[1-2]。當機體交感神經興奮時，如處于低溫環境，白色脂肪會發生棕色化，轉變成米色脂肪組織(beige adipose tissue)[3]，同棕色脂肪一樣，米色脂肪也可以促進代謝產熱[4-5]。民豬的抗寒機理一直是重要的研究方向，豬缺少棕色脂肪，但有研究發現可能存在米色脂肪[6]。

本試驗選取了3個產熱相關基因：1)解偶聯蛋白3(uncoupling protein，UCP3)，解偶聯蛋白受體基因屬于線粒體載體蛋白家族，主要參與機體的能量代謝，也是影響肉質的重要功能基因[7]，UCP3在哺乳動物的產熱和脂代謝調控中有重要作用[8-10]。2)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)，PGC-1α 是參與調節適應性產熱的主因子。研究表明，PGC-1α 在處于寒冷環境中的棕色脂肪和骨骼肌中高表達。PGC-1α作為PPARγ 的輔助激活因子激活了決定棕色脂肪細胞的主要基因，例如UCPs[11]。3)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)，其家族中的PPARα對調節脂肪代謝有重要作用[12]。

本試驗還選取了3個米色脂肪標記基因：1)核轉錄因子(early B-cell factor，EBF)，其家族中的EBF2在脂肪細胞的成熟分化中起關鍵作用[13]；2)四跨膜蛋白家族成員中的分化簇81(cluster designation 81，CD81)，CD81作為細胞表面的免疫調節分子，參與細胞的黏附，影響細胞的生長和分化[14]；3)血小板衍生生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptors，PDGFRα)，PDGFRα是酪氨酸蛋白激酶受體家族成員之一，是一種跨膜糖蛋白，在脂肪組織形成中具有重要作用[15]。

米色脂肪對民豬的抗寒能力起重要作用，本研究通過檢測產熱基因和米色脂肪標記基因的表達為研究民豬抗寒能力提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TRIzol、熒光定量試劑、DMEM/F12培養基購自Life Technologies公司；反轉錄試劑盒、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、胰蛋白酶購自TaKaRa公司；青鏈霉素混合液、IV型膠原酶、油紅O染液、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素、羅格列酮、吲哚美辛、三碘甲狀腺原氨酸(T3)購自Sigma公司；引物由安徽通用生物系統有限公司合成。

1.2 樣品采集

試驗動物來自黑龍江省農業科學院畜牧研究所養殖基地，采集1月齡東北民豬的背部皮下脂肪組織用于前體脂肪細胞的培養。采樣程序:屠宰后迅速去除皮毛，用無菌的剪刀、鑷子剪下1 cm ×1 cm的背部皮下脂肪組織塊。用含有10%雙抗(青霉素和鏈霉素)的無菌PBS溶液沖洗2～3遍后，將組織塊浸泡于15 mL含有雙抗的PBS溶液中，然后冷藏保存帶回實驗室。

1.3 民豬前體脂肪細胞的分離培養

將民豬脂肪塊放于100 mm培養皿中，滴加少量組織消化液(DMEM/F12基礎培養基含1%IV型膠原酶，10 mmoL·L-1CaCl2),并用剪刀將組織塊剪成細小的碎塊。組織剪好后，轉移至50 mL離心管中，加入足量的組織消化液和2%濃度的BSA(用DMEM/F12培養基配置，現用現配)，封口膜封口，置37 ℃搖床中,150 r·min-1震蕩消化40～50 min,期間每10～15 min檢查一次組織消化情況;待組織樣消化完全后,加入等體積的DMEM/F12細胞培養基(含1%雙抗、10%FBS)終止消化;用100 μm細胞篩過濾組織消化產物,將濾液轉移至干凈的50 mL離心管中;1 000 r·min-1離心5 min;棄上清,將細胞沉淀用1 mL細胞培養基重懸，轉移到60 mm培養皿中，再加3 mL細胞培養基后放入37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中過夜。第2天用PBS沖洗培養皿3次，將未貼壁細胞洗去，并加入4 mL DMEM/F12細胞培養基(含1%雙抗、10%FBS)繼續培養，每2 d更換1次培養基，至細胞生長至合適的密度。

1.4 民豬前體脂肪細胞誘導分化

當細胞長滿后，將生長培養基換成含有0.5 mmoL·L-1IBMX、5 μg·mL-1胰島素、1 μmoL· L-1地塞米松、1 μmoL·L-1羅格列酮、1 μmoL·L-1三碘甲狀腺原氨酸 (T3)、1 μmoL·L-1吲哚美辛的DMEM/F12細胞培養基(含1%雙抗、10%FBS)，2 d后換液，替換成只含有5 μg·m L-1胰島素、1 μmoL·L-1三碘甲狀腺原氨酸(T3)及1 μmoL·L-1羅格列酮的DMEM/F12細胞培養基(含1%雙抗、10%FBS)，每2 d換液1次至第8天。在誘導培養的第0、2、4、6、8天收集細胞RNA樣用于檢測基因的表達量。

1.5 油紅O染色法檢測脂滴形成

將誘導分化第8天的民豬前體脂肪細胞拿出，棄去培養皿內培養基，用PBS輕輕地洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min。用PBS洗3次去除多聚甲醛，向培養基中加入油紅O工作液至剛好沒過底部進行染色。染色30 min后，吸出油紅O，再用PBS清洗3次。使用相差顯微鏡觀察。

1.6 基因定量引物設計

利用Primer 5.0在線設計軟件，根據GenBank上豬的UCP3、PGC-1α、PPARα、EBF2、CD81、PDGFRα序列設計定量引物，以β-actin為內參基因，基因的引物序列由安徽通用生物系統有限公司合成。引物序列見表1。

表1 基因定量引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence of genes

1.7 細胞總RNA的提取、檢測和反轉錄

按照TRIzol試劑盒使用說明提取民豬前體脂肪細胞誘導分化細胞的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳法對提取的總RNA進行質量檢測。提取的RNA經反轉錄得到cDNA，反應體系：1)5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Erase 1 μL，RNA (1 000/RNA 濃度)μL，Free H2O補足10 μL。擴增條件：42 ℃ 2 min，16 ℃ 1 min；冰浴2 min。2)Primre Seript RT Enzyine Mix I 1 μL,RT Primer Mix 1 μL，5×Primre Seript Buffer2 4 μL，Free H2O 4 μL。擴增條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，16 ℃ 1 min。

1.8 qRT-PCR驗證

用設計的定量引物(表1)進行實時熒光定量PCR反應，反應體系:cDNA樣品0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌水補充至20 μL。每個樣品重復3次。擴增條件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線程序為：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min。每組試驗重復3次。采集熒光信號繪制擴增曲線和熔解曲線。

1.9 數據統計分析

以β-actin基因為內參，qRT-PCR數據采用2-ΔΔCt法分析，計算UCP3、PGC-1α、PPARα、PDGFRα、EBF2、CD81每個基因的相對表達量。試驗均設置3個重復，所有數據使用GraphPad Prisms軟件中的One-way ANOVA進行方差分析和顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 脂肪細胞RNA的提取

本試驗采用TRIzol法提取細胞不同誘導時間點的RNA,并用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。從圖1 中可以看出，所有樣品的 RNA 在凝膠上均顯示出3條清晰明亮的條帶，由上至下分別為28S、18S、5S。經紫外分光光度計測定，提取的總 RNA 質量較好，可用于后續基因表達量的檢測。

圖1 RNA電泳圖Fig.1 RNA detection electrophoresis map

2.2 民豬前體脂肪細胞誘導分化及油紅O鑒定

前體脂肪細胞在不誘導分化正常傳代培養時只會出現少數分化現象，由圖2可以看到誘導處理第0 天時細胞呈長梭形，幾乎沒有脂滴形成，在加入誘導分化試劑培養第2天時，視野中出現了亮的脂滴，第4天明顯看到形成的脂滴變多，并有聚攏的趨勢，當誘導分化第6天時，開始出現大片脂滴聚攏現象，從圖中可以看到脂滴覆蓋率達到60%，第8天時，視野下是大片脂滴，覆蓋率達80%，有的地方出現脂滴重疊現象。在第8天進行油紅O染色，也可以清晰看到脂滴被染成紅色，確定誘導分化成功。

A～E.誘導分化第0、2、4、6、8天細胞形態；F.第8天油紅O染色細胞形態A-E.Cell morphology on day 0,2,4,6 and 8 of differentiation;F.On day 8,the morphology of cells stained with Oil red O圖2 誘導分化和油紅O染色的民豬前體脂肪細胞(100×)Fig.2 Adipogenic differentiation and Oil red O staining of preadipocytes of Min pig(100×)

2.3 目的基因在民豬前體脂肪細胞中的表達

2.3.1 產熱相關基因表達UCP3表達量隨著脂肪細胞的分化其表達量持續升高，在第6天時達到最高值，為第0 天時表達量的164倍(P<0.01)，第8天時表達量略有降低，但仍為第0天時的63倍(P<0.01)(圖3)；PGC-1α基因在誘導分化后第2天 表達量最高，達到第0天的334倍(P<0.01)(圖3)，第4、6 和8天時的表達量與第2天比較有較大幅度地降低，但也分別達到第0天表達量的35、22和13倍(圖3)；PPARα的表達量在誘導后的第2天達到第0天表達量的7倍(P<0.01)，并在此后始終保持4～7倍的較高表達量(P<0.01)(圖3)。

不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)。下同Different uppercase letters indicate extremely significant differences among different groups(P<0.01).The same as below圖3 產熱相關基因表達情況Fig.3 Expression of genes related to thermogenesis

結合3種產熱相關基因在脂肪細胞成熟分化過程中的表達趨勢可見(圖3)，當前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程中，與產熱相關的基因表達量迅速提高，雖然在完成成熟轉化后表達量有所降低，但相比于未分化狀態時依然終保持了較高的表達水平。

2.3.2 米色脂肪轉化相關基因表達EBF2基因在誘導分化后的第2天表達量最高，達到第0天的29倍(P<0.01)，在第4、6 和8 天時的表達量比第2天有較大幅度地降低，但也達到第0天表達量的7、9和4倍(圖4)；CD81基因在第2、4天的表達量為第0天表達量的4倍左右(P<0.01)，第8天和第0天的表達量接近，為第0天表達量1.2倍(圖4)。PDGFRα基因的表達量在第2天時最高，為第0天表達量的5倍(P<0.01)，第4天為第0天表達量的3倍(P<0.01)，第6天幾乎與第0天相同，第8 天時低于第0天的表達量(圖4)。結合3種米色脂肪轉化相關基因表達情況可見(圖4)，當前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程中米色脂肪特異性基因發生表達。

圖4 米色脂肪轉化相關基因表達情況Fig.4 Expression of genes related to beige fat transformation

3 討 論

3.1 脂肪細胞分化過程中產熱相關基因的表達

UCP3基因屬于線粒體載體基因家族，主要參與線粒體呼吸鏈的解偶聯作用，用于機體非戰栗產熱。目前，對豬UCP3基因的研究主要集中在多態性分析及其對脂肪沉積和肉品質的影響[16-17]。Lin等[18]證明，1周齡藏豬受到冷刺激后出現米色脂肪組織，UCP3基因表達量顯著上調，介導機體脂肪組織產熱，抵抗寒冷環境對機體的影響。PGC-1α是一種轉錄共激活因子，是參與調節適應性產熱的主因子，主要在棕色脂肪組織中表達，當小鼠處于冷暴露時，PGC-1α在白色脂肪組織中含量明顯增加，并進一步促進UCP1的表達，說明其在促進白色脂肪棕色化中有重要作用[19-20]。PPARα高表達于代謝活性強的組織，如肝、心、肌肉和米色脂肪組織。肝內，PPARα參與調控肝內的3條脂肪酸氧化代謝通路(過氧化物酶體和線粒體β-氧化及微粒體ω-氧化)，控制著肝內脂質及機體能量平衡。在米色脂肪細胞和巨噬細胞分化及饑餓過程中，PPARα的表達水平均升高[21]。研究發現，PGC-1α和PPAR家族共同作用于UCP3，是UCP3基因分子調控的重要組成部分，同時UCP3對于PGC-1α誘導的氧化能力至關重要[22]。本研究中，PGC-1α和PPARα在第2天有較高表達，UCP3表達量在2 d 后逐漸升高，說明隨著時間的增加PGC-1α和PPARα促進UCP3的表達，符合上述研究結果。UCP3、PGC-1α、PPARα表達量的升高說明細胞產熱能力明顯增加。

3.2 脂肪細胞分化過程中米色脂肪標記基因的表達

EBF2、PDGFRα、CD81是研究發現的米色脂肪標志性基因。通過對小鼠EBF2基因的敲除發現，EBF2控制著小鼠米色脂肪細胞的形成[23]。EBF2通過增加PGC-1α的表達來促進產熱基因轉錄，從而促進米色脂肪細胞生成[24]。EBF2在成人棕色前體脂肪中高豐度表達，表明其在人類棕色前體脂肪的形成過程中也發揮著重要的調控作用[25]。EBF2缺失小鼠的棕色脂肪細胞和組織顯示出棕色特異性特征和產熱能力的喪失，確定了EBF2是棕色脂肪細胞功能的關鍵轉錄調節因子。通過在小鼠中研究皮下和內臟脂肪發現，PDGFRα信號傳導促進米色脂肪細胞生成[26-27]。CD81是在研究中發現的一種新的更準確的米色脂肪標志基因，Oguri等[28]將CD81+和CD81-細胞分別從小鼠的腹股溝脂肪中分選出來并進行體外培養，結果發現，只有CD81+細胞能夠分化成成熟的脂肪細胞并表達多個米色脂肪所特有的基因。本研究中，EBF2、CD81和PDGFRα在前體脂肪細胞中均有表達，且在誘導分化的第2天出現最高表達量，隨著誘導時間的繼續增加，表達量明顯降低，可能是前體脂肪細胞更多向白色脂肪細胞轉化而向米色脂肪細胞轉化的較少。

4 結 論

本研究結果顯示，在民豬的前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞誘導分化的過程中，產熱和米色脂肪標記相關基因的表達會隨著誘導時間的增加而產生規律性變化。產熱相關基因的表達量會隨著誘導時間的增加而增加，并維持較高水平；而米色脂肪標記基因在誘導第2天表達量最高，隨后則明顯降低。本研究結果說明，前體脂肪細胞的分化具有明顯的階段特異性，為進一步分析如何影響民豬前體脂肪細胞向米色脂肪細胞的分化，以及從分子角度研究民豬抗寒機理提供參考。