食品中沙門氏菌檢驗能力驗證分析

◎ 胡淑青

（從化海關綜合技術服務中心，廣東 廣州 510900）

實驗室質量控制方式主要分為外部質量控制和內部質量控制兩大類。參加能力驗證活動是認可實驗室開展外部質量控制的重要方式之一，可直觀顯示參試實驗室的技術能力，幫助參試實驗室及時發現潛在問題并及時采取糾正或預防措施，進而提高實驗室運行管理的能力與信心。

沙門氏菌屬（Salmonella）分類屬腸桿菌科，是一類分布廣泛、血清型較多、抗原復雜的腸道病原菌[1]，可引起人類的傷寒、副傷寒、感染性腹瀉、食物中毒和醫院內感染，并引起動物發生沙門氏菌病[2]。引起沙門氏菌中毒的食品主要是肉類、蛋類和乳類，日本則以魚類為多，我國以肉類食品為主，主要是牛肉、豬肉和馬肉[3]。

從化海關綜合實驗室常年承擔的食品法定檢驗及社會委托檢驗中，沙門氏菌是微生物檢驗的常檢項目。實驗室于2020年8月參加廣州海關技術中心組織的“IQTC20B12食品中沙門氏菌的檢驗”能力驗證項目。根據國標《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）[4]對兩樣品進行檢驗，最終獲得滿意的結果評價。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

兩待測樣品編號分別為PT082和PT126，為西林瓶密封裝的菌株凍干粉，由廣州海關技術中心提供。

1.2 培養基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）顆粒培養基、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養基、三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗培養基、營養瓊脂（NA）平板和EasyID沙門氏菌生化鑒定盒，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。沙門氏菌診斷血清（A-F），購自寧波天潤生物藥業有限公司。

1.3 參考標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心。

1.4 儀器設備

MDF-192N超低溫冰箱（日本SANYO）；HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋（日本HIRAYAMA）；GI7-2生化培養箱（美國SHEL LAB）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO）；Mili-Q Direct 16超純水機（美國MILLIPORE）。

1.5 方法

1.5.1 樣品處理及預增菌

從超低溫冰箱（-80 ℃）取出待測樣品，靜置至室溫。西林瓶內含奶粉為基質的凍干粉，在生物安全柜內無菌操作開啟西林瓶，加入5 mL滅菌生理鹽水復溶，用無菌吸管轉移樣品液體至盛有225 mL滅菌BPW的錐形瓶中，隨后每次5 mL分4次用滅菌生理鹽水潤洗西林瓶后將清洗液回收至上述錐形瓶中。編號PT082和編號PT126樣品分別處理后做好編號標記。同樣方式接種鼠傷寒沙門氏菌做陽性對照。

將預處理后的編號分別為PT082和PT126的錐形瓶置于生化培養箱（36 ℃）培養18 h。

1.5.2 增菌

輕搖PT082、PT126和對照組的BPW培養物，各移取1 mL，分別轉于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液，輕輕搖勻。SC置于生化培養箱（36 ℃）培養22 h，TTB置于生化培養箱（42 ℃）培養22 h。

1.5.3 選擇性分離

輕搖增菌液，將其分別劃線接種于BS平板、XLD平板、HE平板和沙門氏菌屬顯色平板。接種后的XLD平板、HE平板和沙門氏菌屬顯色平板置于生化培養箱（36 ℃）培養24 h，BS平板培養48 h。

1.5.4 生化試驗

對照國標，自選擇性平板上挑取典型或可疑菌落，接種三糖鐵（TSI）瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺，無需換新接種環，繼續接種賴氨酸脫羧酶試驗培養基和營養瓊脂（NA）平板，置于生化培養箱（36 ℃）培養24 h。

對照國標，對初步生化試驗結果判斷為可疑沙門氏菌屬的菌落使用EasyID沙門氏菌生化鑒定盒進行鑒定。

1.5.5 血清學鑒定

將步驟1.5.4符合沙門氏菌屬生化反應特性的菌落進行血清凝集試驗。在無菌培養皿上滴加1滴沙門氏菌診斷血清（A-F），用無菌接種環挑取單菌落于診斷血清中輕輕攪拌勻，觀察是否有顆粒狀的凝集現象。同時用生理鹽水作對照排除菌落自凝可能性。

2 結果與分析

2.1 選擇性分離結果

各選擇性平板的菌落特征見表1。對照國家標準，觀察到編號PT082樣品在SC增菌液以及編號PT126樣品在TTB增菌液分別劃線接種的培養物在選擇性平板的菌落形態特征疑似沙門氏菌。同時，觀察到編號PT082樣品在TTB增菌液以及編號PT126樣品在SC增菌液分別劃線接種的培養物在選擇性平板的菌落形態特征與沙門氏菌的菌落特征相似度不大。

表1 選擇性瓊脂平板上菌落形態表

2.2 初步生化試驗結果

樣品初步生化試驗結果見表2。其中，XLD（PT082，SC）表示編號PT082樣品在SC增菌液劃線接種的XLD平板；BS（PT126，TTB）表示PT126樣品在TTB增菌液劃線接種的BS平板；HE（PT126，SC）表示編號PT126樣品在SC增菌液劃線接種的HE平板；沙門氏菌屬顯色平板（對照，TTB）表示陽性對照品在TTB增菌液劃線接種的沙門氏菌屬顯色平板。對照國家標準，初步判斷樣品PT082和樣品PT126為可疑沙門氏菌屬。

表2 樣品初步生化試驗結果表

2.3 全面生化鑒定結果

樣品全面生化試驗結果見表3。

表3 樣品全面生化試驗結果表

2.4 血清學鑒定結果

樣品血清學鑒定結果見表4。對照國標，綜合表1～表4，可判定本次能力驗證兩樣品（PT082和PT126）均檢出沙門氏菌。

表4 樣品血清學鑒定結果表

3 結論與討論

采用傳統國標方法檢驗沙門氏菌，耗時較長但方法成熟，仍是目前較為通用的檢驗方法。利用BPW預增菌，可以使沙門氏菌得到一定的增殖，提高陽性檢出率。在實際檢驗中，對于未加工的生鮮食品或污染較嚴重的樣品，可使用SC增菌液和TTB增菌液直接增菌。在選擇性瓊脂平板的選擇上，國標法顯示BS平板是必需，再另選XLD平板、HE平板、顯色平板其中之一搭配使用。BS平板較之于上述3種平板培養時間較長，一般需要培養48 h，在實際檢驗中，建議選用3種或以上選擇性平板分離培養細菌。特異性和靈敏度較強的顯色培養基推薦使用，可輔助提高檢驗效率。

國標法顯示，初步生化試驗中利用三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基反應結果首先排除非沙門氏菌的可能性。三糖鐵瓊脂因含有乳糖、蔗糖和葡萄糖3種糖（比例為10∶10∶1）而得名。只能利用葡萄糖的細菌，分解葡萄糖產酸使斜面先變黃，但因葡萄糖量少，生產的少量酸因接觸空氣而氧化。斜面葡萄糖被分解完，蛋白胨繼而被細菌利用從而產堿，故斜面由黃變為深紅（通過酚紅指示劑顯示）。瓊脂底部處于缺氧狀態，酸類物質難以揮發，因此保持黃色。三糖鐵變黑原因在于某些細菌能夠將硫代硫酸鈉還原為硫化氫，硫化氫與硫酸亞鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化亞鐵。樣品HE（PT126，SC）的三糖鐵瓊脂反應結果為A/A，產氣（+），產硫化氫（-），配合賴氨酸試驗陰性結果，可判斷此細菌為非沙門氏菌。最后補充說明，三糖鐵瓊脂斜面可以自制亦可選用生物公司生產的即用型，自制斜面選用試管塞加塞試管方式，帶微孔的試管塞可讓細菌培養時候較為均勻利用空氣成分呼吸代謝；而即用型斜面多采用旋鈕蓋子加蓋玻璃瓶子方式（由于生產滅菌流程及運輸儲存需要），因此在培養過程中，建議旋上蓋子七八成松緊度，既可以令細菌利用糖類代謝產生的酸性物質及氣體緩慢揮發，亦可避免蓋子旋緊度不夠情況下，某些細菌利用糖類大量產酸產氣導致空間內氣壓過高將蓋子沖出。

本次能力驗證實驗最后一步血清學鑒定，用沙門氏菌O多價血清（A～F）進行凝集分群（95%以上的沙門氏菌屬屬于A～F群），只鑒定到屬?；乜磭鴺?，沙門氏菌血清型分型是選做項目，需要進一步利用O因子血清將可疑菌鑒定到群，再用H因子血清第一相（特異相）定型，最后用H因子第二相（非特異相）輔助定型。沙門氏菌屬在電鏡下觀察形態相似，可是基于其表面的O抗原和H抗原的不同組合卻能分出許多血清型。據美國疾病控制與預防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）資料顯示，超過2 500種沙門氏菌血清型已被區分并命名，但由于眾多血清型都非常罕有，科學家們對其了解尚不深入[5]。

本次能力驗證報告兩樣品均檢出沙門氏菌，獲得組織方的滿意評價。參加能力驗證活動，可以夯實實驗室技術能力，對于參試實驗人員而言，亦是一次很好的實踐機會。