山羊副流感病毒3型和巴氏桿菌混合感染的診斷與病原分離鑒定

惲佳蕾 毛立 楊蕾蕾 何苗峰 李文良 張紋紋 孫敏 劉茂軍

摘要：隨著規(guī)模化養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，肉羊呼吸道疾病流行普遍、發(fā)病嚴(yán)重、防治困難，給養(yǎng)殖業(yè)及養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為明確安徽某肉羊養(yǎng)殖場(chǎng)呼吸道疾病的病因，結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢病變觀察、細(xì)菌學(xué)及病毒學(xué)檢測(cè)與分離鑒定以及血清學(xué)檢測(cè)對(duì)病因進(jìn)行分析，結(jié)果表明該病是由山羊副流感病毒3型與巴氏桿菌混合感染所致。分離菌株對(duì)丁胺卡那霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、恩諾沙星和頭孢曲松敏感，對(duì)青霉素、克林霉素和強(qiáng)力霉素不敏感。通過MDBK細(xì)胞成功分離獲得山羊副流感病毒3型毒株，其M基因片段與已有毒株同源性達(dá)99%。血清學(xué)檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)病毒的感染。這為臨床上科學(xué)防控山羊呼吸道疾病提供了指導(dǎo)和借鑒。

關(guān)鍵詞：山羊副流感病毒3型;巴氏桿菌;呼吸道疾病;混合感染;分離鑒定

中圖分類號(hào)：S858.27?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）11-0124-03

收稿日期：2020-12-06

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（19）3020];國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0500900）。

作者簡(jiǎn)介：惲佳蕾（1996—），女，江蘇無(wú)錫人，碩士研究生，從事食源性/人獸共患傳染病防控技術(shù)研究。E-mail：834462138@qq.com。

通信作者：李文良，博士，研究員，主要?jiǎng)游镏匾≡腥局虏C(jī)制與防控技術(shù)研究。E-mail：kfliwenliang@163.com。

近年來，隨著規(guī)模化養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，肉羊呼吸道疾病流行普遍、發(fā)病嚴(yán)重、防治困難，給養(yǎng)殖業(yè)及養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。研究表明，與牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）是由多種病毒、細(xì)菌感染導(dǎo)致的[4]類似，臨床上肉羊呼吸道疾病的發(fā)生可由多種病毒[如山羊副流感病毒3型（CPIV3）、小反芻獸疫病毒（PPRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）]和細(xì)菌性病原（巴氏桿菌、曼氏桿菌、綿羊肺炎支原體、腸外致病性大腸桿菌、鏈球菌等）單獨(dú)或混合感染引起，尤其在機(jī)體健康狀態(tài)低下、環(huán)境改變、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激條件下引起嚴(yán)重的臨床癥狀[1，3，5-6]。

2020年9月，安徽一山羊養(yǎng)殖場(chǎng)外購(gòu)育肥山羊（182頭）于到場(chǎng)后10 d陸續(xù)發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道疾病，治療效果較差。發(fā)病羊主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流涕、精神萎靡，嚴(yán)重者呼吸困難并出現(xiàn)死亡。剖檢2只病死羊均可見肺臟嚴(yán)重實(shí)變、化膿并與胸腔、心包膜黏連，胸腔積液，氣管出血并充滿泡沫與黏液。發(fā)病率約35%，死亡率8.2%。為查明病因，本研究結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢病變觀察、病原學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)以及病原分離鑒定等方法對(duì)病因進(jìn)行分析，明確致病病原，為該病的防治提供指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNA/DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自Axygen公司;一步法RT-PCR試劑盒、胎牛血清、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 plus，購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司;PCR Mix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;血平皿、藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;革蘭氏染色液，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自Hyclone公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1 染色與鏡檢 取肺、肝組織病料，涂布于綿羊血平板，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)，24 h后取出。挑取典型菌落涂片并進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌16S rRNA序列測(cè)定 挑取純化的菌落，采用16S rRNA通用引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段為1 500 bp。引物序列如下：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R：5′-GGWTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系為20 μL，2×PCR buffer 10 μL，引物各為1 μL，提取的核酸4 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增后PCR樣品于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果。用膠回收試劑盒將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行BLAST分析。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 挑取純化培養(yǎng)的菌落，涂布血平板，用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。37 ℃培養(yǎng)一晝夜，觀察結(jié)果，根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100-S21標(biāo)準(zhǔn)判定敏感性[7]。

1.3 病毒與支原體檢測(cè)

分別取200 μL鼻拭子（2份）、肺臟組織勻漿上清（2份）樣品，按照RNA/DNA提取試劑盒說明書提取樣品中的核酸。分別使用CPIV3、RSV、PPRV、綿羊肺炎支原體的引物分別進(jìn)行RT-PCR或PCR檢測(cè)（引物序列如表1所示），一步法RT-PCR和PCR反應(yīng)均參照試劑說明書進(jìn)行。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.4 病毒分離與序列分析

選取CPIV3檢測(cè)陽(yáng)性的鼻拭子樣品，參照文獻(xiàn)[6]方法采用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離、傳代，觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，檢測(cè)病毒血凝價(jià)。采用RT-PCR檢測(cè)CPIV3，將擴(kuò)增產(chǎn)物送南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行BLAST分析。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)

按照?qǐng)?bào)道的阻斷ELISA方法[11]對(duì)發(fā)病期（15份，其中2份為剖檢羊）和1個(gè)月后（31份）采集的血清樣品進(jìn)行CPIV3抗體檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定

從肺臟、肝臟樣品中均分離到單一的透明、濕潤(rùn)、光滑、不溶血的小菌落。染色后鏡檢可見大量革蘭氏陰性桿菌并呈兩極著染。菌落PCR后電泳結(jié)果顯示，得到的擴(kuò)增的核苷酸片段與預(yù)期結(jié)果大小相符。測(cè)序表明，該菌株16S rRNA基因部分序列與巴氏桿菌同源性最高。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，此菌對(duì)丁胺卡那、氟苯尼考、阿奇霉素、恩諾沙星和頭孢曲松敏感（表2）。

2.2 病毒檢測(cè)與分離鑒定

結(jié)果顯示，2份鼻拭子和1份肺臟樣品檢測(cè)到CPIV3為陽(yáng)性，而RSV、PPRV和綿羊肺炎支原體均未檢出（圖略）。

選擇陽(yáng)性的鼻拭子樣品經(jīng)離心、過濾除菌后接種MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，接種后4 d可見細(xì)胞出現(xiàn)CPE，傳代至第二代時(shí)3 d即可出現(xiàn)明顯的CPE，5 d時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)融合、死亡、脫落（圖1），與已有報(bào)道[6]一致。通過血凝試驗(yàn)檢測(cè)第3代病毒血凝價(jià)為128。對(duì)第3代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性（圖略）。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行BLAST分析，與已報(bào)道CPIV3毒株同源性為99%。

2.3 CPIV3抗體檢測(cè)

采用阻斷ELISA方法檢測(cè)采集的血清樣品，結(jié)果見圖2。發(fā)病早期采集的15份血清樣品抗體陽(yáng)性率為53.33%，但阻斷率不高，有6份樣品在臨界值（35%）左右，2份剖檢病死羊的血樣均為陰性。發(fā)病1個(gè)月后血清抗體陽(yáng)性率為96.77%，絕大多數(shù)阻斷率達(dá)到70%以上，僅有1份為陰性。

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理觀察和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，綜合判定發(fā)病羊場(chǎng)為CPIV3和巴氏桿菌的混合感染。建議對(duì)發(fā)病羊隔離飼養(yǎng)，使用專用的器具與飼料等;對(duì)死亡羊尸體及圈舍、糞便等污染物進(jìn)行無(wú)害化處理;對(duì)整個(gè)羊舍，尤其對(duì)發(fā)病羊舍及其污染的環(huán)境、器具等進(jìn)行全面消毒，1～2 d/次;對(duì)發(fā)病羊使用氟苯尼考、氟尼辛葡甲胺和維生素C注射治療，療程3～7 d，同時(shí)采用氟苯尼考進(jìn)行全群預(yù)防用藥2次，1周后病情逐步好轉(zhuǎn)，死亡率顯著降低，1個(gè)月后回訪已基本恢復(fù)正常。

近年來，隨著國(guó)內(nèi)養(yǎng)羊規(guī)模化的發(fā)展，集約化增加、流通運(yùn)輸頻繁，但相應(yīng)的防疫措施不到位，相關(guān)疾病頻發(fā)，逐漸引起大家關(guān)注，其中呼吸道疾病造成的危害最為突出。臨床上肉羊呼吸道疾病的發(fā)生可由多種病毒和細(xì)菌性病原引起，疾病的嚴(yán)重程度與感染病原的致病性、混合感染的程度以及應(yīng)激、飼養(yǎng)管理等有關(guān)。小反芻獸疫致病性強(qiáng)，自2014年流行以來已通過疫苗免疫得到有效控制，但仍有散發(fā)的病例[12-13]。養(yǎng)殖戶需提高防范意識(shí)，做好疫苗免疫，定期監(jiān)測(cè)抗體水平，保證免疫效果。CPIV3是新近報(bào)道的羊源副流感病毒，其流行分布較廣，尚無(wú)疫苗和特效藥物，應(yīng)給予重視并采取預(yù)防為主的措施[6，14]。此外，根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室調(diào)查發(fā)現(xiàn)，綿羊肺炎支原體流行普遍[15]，危害較大且缺乏針對(duì)性的疫苗，巴氏桿菌、曼氏桿菌、腸外致病性大腸桿菌等常與之混合感染。針對(duì)這些細(xì)菌性病原，應(yīng)重視病原的檢測(cè)、鑒定，篩選敏感藥物進(jìn)行治療。本病例中檢測(cè)到CPIV3與巴氏桿菌混合感染，未檢測(cè)到PPRV和綿羊肺炎支原體，該株巴氏桿菌耐藥性不強(qiáng)，但養(yǎng)殖戶最初使用的是不敏感藥物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整藥物并配合對(duì)癥支持治療藥物后即收到良好的效果，發(fā)病率和死亡率明顯下降并最終恢復(fù)正常。

總之，面對(duì)規(guī)模化養(yǎng)殖模式下肉羊呼吸道疾病多發(fā)難防的問題，養(yǎng)殖戶和研究人員均應(yīng)給予足夠的重視，貫徹預(yù)防為主的綜合防控措施，發(fā)病后應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)科學(xué)分析病因并采取針對(duì)性的防治方案，最大限度降低造成的損失。

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