蘇淮仔豬腹瀉細菌性病原的分離鑒定與耐藥性分析

王禮偉 周剛 柏傳茂 楊生明 郭永久 唐炎 汪國蓮

摘要：為了解淮安地區蘇淮豬仔豬出現細菌性腹瀉的病因并提供治療方案，采集腹瀉仔豬的肛拭子樣品共95份，對采集的樣品進行細菌分離與鑒定、動物致病性鑒定及耐藥性分析。結果顯示，本次試驗共分離鑒定到78株大腸桿菌，92株沙門氏菌;動物致病性試驗顯示，大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%，沙門氏菌致小鼠死亡率為95.84%;藥敏試驗結果顯示，大腸桿菌耐藥率高于沙門氏菌，且均對青霉素類和林可霉素類高度耐藥，對氟喹諾酮類耐藥率最低。多重耐藥結果顯示，所有分離菌株均為多重耐藥菌株，大腸桿菌主要表現8～10耐，沙門氏菌主要表現在6～8耐。

關鍵詞：仔豬;腹瀉;大腸桿菌;沙門氏菌;耐藥性

中圖分類號： S855.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0127-05

收稿日期：2020-09-08

基金項目：蘇北科技專項科技幫扶項目（編號：SZ-HA2019032）;淮安市農科院科研發展基金項目（編號：HNY202025）。

作者簡介：王禮偉（1989—），男，江蘇淮安人，碩士，助理研究員，主要從事動物傳染病防控及農業科技服務。E-mail：wlw58@sian.cn。

通信作者：汪國蓮，碩士，研究員，主要從事農業科技服務。E-mail：2567327519@qq.com。

仔豬腹瀉伴有不同程度的腹瀉、脫水、自身免疫力下降，是仔豬死亡和繼發其他疾病的重要原因，影響養豬生產效率和盈利情況，給養豬業帶來嚴重的經濟損失，主要體現在發病率高、降低日增質量、延長出欄時間、飼料轉化率下降、飼料成本增加等 [1-2]。仔豬腹瀉是病原體、腸道環境和管理之間相互作用的結果，其中病原體的感染是導致仔豬發生腹瀉的主要原因，根據病原體的不同，細菌引發的可分為埃希氏大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌等;病毒引發的如流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、非洲豬瘟病毒等;寄生蟲引發的如剛地弓形蟲、艾美耳球蟲等 [3]。鑒于細菌性腹瀉在規模化養豬場患病中的普遍性和重要性，為進一步了解淮安地區蘇淮仔豬腹瀉細菌性病原流行病學和抗生素耐藥情況，本試驗采集腹瀉仔豬的肛拭子樣本進行了細菌的分離鑒定、致病力試驗及耐藥性分析，旨在為疾病防控、減抗禁抗、食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2020年1月至4月采集來自淮安地區3個蘇淮豬養殖場出現腹瀉癥狀的仔豬肛拭子95份。發病仔豬主要表現為精神不振、食欲不佳、被毛聳亂、拉黃白色稀軟或水樣糞便等。以滅菌棉拭子采集發病仔豬肛拭樣品置于滅菌EP中，保存于-20 ℃冰箱待用。

1.1.2 試驗材料 麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基、MH瓊脂培養基、MH液體培養基均購自青島海博生物技術有限公司;無菌脫纖維兔血瓊脂培養基的制備參考文獻 [4];獸醫臨床常用藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司，包括紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環素、四環素、頭孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

1.2 方法

1.2.1 細菌的富集、分離與純化 將采集的肛拭子接種于5 mL MH液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h。然后用接種環按照常規細菌分離方法分別接種（“Z”字形）于麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h。挑取典型單個菌落接種于5 mL MH液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h，劃線接種到無菌脫纖維兔血瓊脂培養基中，37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察菌株溶血情況，同時接種到MH液體培養基中備用。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢 將無菌脫纖維兔血瓊脂培養基中單個菌落進行涂片、革蘭氏染色、顯微鏡油鏡下觀察菌體的形狀及染色特性。

1.2.3 細菌生化鑒定試驗 將待檢菌落按照伯杰氏生化鑒定手冊進行生化鑒定。

1.2.4 動物致病性試驗 將小鼠分成A、B、C 3組。A、B組小鼠分別依據體質量按0.02 mL/g腹腔注射經鑒定純化的大腸埃希氏菌和沙門氏菌菌液，每種菌注射2只，C組小鼠分別依據體質量按0.02 mL/g 腹腔注射無菌生理鹽水。接種后觀察并剖檢發病和死亡的小鼠，統計致病率。

1.2.5 藥敏試驗 吸取致死小鼠菌液100 μL置于MH瓊脂培養基上，涂布涂勻，3～5 min后，待菌液干燥后，均勻貼上4片不同的藥敏紙片（d=6 mm），參照文獻 [4]的方法，放置恒溫箱培養18～24 h后測量抑菌環的直徑，根據抑菌圈的大小，根據《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》 [5]判定結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定結果

對腹瀉仔豬肛拭子樣本進行選擇分離鑒定，由圖1～圖6可知，疑似大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養基上長出粉紅色、光滑、濕潤、邊緣整齊、直徑1.0～2.5 mm的菌落，其中12株在血瓊脂培養基上生成透明溶血環;挑取典型單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，疑似大腸桿菌為兩端鈍圓、散在或成對、紅色、革蘭氏陰性短桿菌。疑似沙門氏菌在SS瓊脂上長出乳白色、圓形、邊緣整齊、光滑、表面有隆起、中間有針狀黑點的小菌落，其中12株在血瓊脂培養基上生成透明溶血環;挑取典型單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，疑似沙門氏菌為無莢膜、無芽孢、散在的革蘭氏陰性直桿菌。

2.2 細菌生化鑒定結果

分離的疑似大腸桿菌最終有78株能夠發酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應陽性，MR反應陽性，V.P.反應陰性，檸檬酸鹽反應陰性，三糖鐵斜面底部產酸及產氣、不生成硫化氫，符合大腸桿菌的生化特性;分離的疑似沙門氏菌最終有92株發酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應陰性，MR反應陽性，V.P.反應陰性，檸檬酸鹽反應陽性，三糖鐵斜面產堿、底部產酸及產氣產硫化氫，符合沙門氏菌的生化特性。最終，分離鑒定得到78株大腸桿菌，分離率為82.10%（78/95）;分離到92株沙門氏菌，分離率為96.84%（92/95）。

2.3 細菌致病性試驗結果

將分離鑒定的78株大腸桿菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠被毛粗亂、喜臥少動、精神沉郁、厭食、排松軟糞便等癥狀;48 h后開始死亡，剖檢發現腹腔充滿黏性黃色滲出物，肝臟、腎臟、脾臟腫大，腸道膨脹充氣，劃線培養后均能分離鑒定到大腸桿菌，大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%（51/78，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）。將分離鑒定的92株沙門氏菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠精神萎靡、戰栗、被毛蓬松，少數出現便血、水樣糞便等癥狀;48 h后開始死亡，剖檢發現小鼠腸道充血、腹腔積水、肝臟和脾臟均有壞死點，劃線培養后均能分離到沙門氏菌，沙門氏菌致小鼠死亡率為94.57%（87/92，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）;對照組小鼠均正常。

2.4 細菌耐藥性試驗結果

對致死小鼠的51株大腸桿菌和87株沙門氏菌進行藥敏試驗，由表1可知，分離鑒定的51株大腸桿菌對林可霉素（100.00%）、青霉素（98.04%）、克林霉素（96.08%）、紅霉素（94.12%）、阿奇霉素（90.20%）高度耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率分別為：利福平（84.31%）、鏈霉素（82.35%）、頭孢唑啉（74.51%）等;分離鑒定的87株沙門氏菌對青霉素（94.25%）、林可霉素（90.80%）、克林霉素（87.36%）、多西環素（82.76%）高度耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率分別為：紅霉素（59.77%）、阿奇霉素（55.17%）等。

2.5 細菌多重耐藥結果

由圖7可知，分離菌株多重耐藥結果，51株大腸桿菌中分離株中8～10重耐藥的占比最大，累計比例為72.55%（37/51），其中，最高為9重，耐藥比例為29.41%（15/51），1～4重耐藥菌株數為0%（0/51）。87株沙門氏菌分離株中6～8重耐藥的占比最大，累計比例為68.96%（60/87），其中，最高為7重，耐藥比例為28.74%（25/87），1～3重和11～12重耐藥的菌株數為0%（0/87）。

3 討論

根據國家統計局發布數據，受非洲豬瘟疫情的影響，2019年我國生豬存欄31 041萬頭，同比下跌27.5%;生豬出欄54 419萬頭，同比下跌21.6%，而仔豬作為育肥豬的種苗，提高仔豬存活率至關重要 [6]。腹瀉是豬場常見傳染病之一，然而腹瀉的流行病學原因卻十分復雜，自身生理因素、飼料營養缺乏、環境應激和飼養管理不當及其他病原體感染等因素，均可能會導致仔豬腸道生態內環境改變，使得變形菌門中的大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等條件致病菌在內的多種菌群失調，最終導致仔豬細菌性腹瀉等癥狀 [7-8]，Hermann-Bank等發現，腸桿菌屬、腸球菌屬增加了新生仔豬腹瀉的風險且與腸道微生物變異密切相關，且使用疫苗接種或抗生素治療效果有限 [9]。本試驗對當地蘇淮豬仔豬腹瀉的細菌性病原進行分離培養鑒定，95份樣本共分離出170 株病菌，大腸桿菌陽性率82.10%（78/95），沙門氏菌陽性率96.84%（92/95），混合感染率為73.68%（70/95）。黃美州等對甘肅地區新生仔豬腹瀉細菌性病原調查后發現大腸桿菌與沙門氏菌混合感染最終導致仔豬嚴重腹瀉 [10];李晨等從貴州地區7個養殖場128份仔豬腸道樣本中分離到大腸桿菌的陽性率為60.94%（78/128），沙門氏菌的陽性率為16.41%（21/128） [11];李淑紅等在湘西北地區豬場檢測到沙門氏菌分離率為55.56%（10/18），大腸桿菌分離率為44.44%（8/18） [12];曲歌等在吉林地區21家規模化豬場117份仔豬腹瀉糞便樣本中進行PCR檢測，分離出大腸桿菌104份，其中49份具有致病性，占樣本總數的42.88%;分離出沙門氏菌19份，其中15份具有致病性，占樣本總數的12.82% [13]，這進一步說明大腸桿菌在感染仔豬的普遍性，而沙門氏菌分離率差異性可能是由于地域差異、動物健康程度及養豬場用藥情況不同所致。

另動物感染試驗結果顯示，大腸桿菌和沙門氏菌的致死率分別為65.38%（51/78）和94.56%（87/92），其中，溶血性菌株的致死率為100%，表明淮安地區分離菌株具有較強的毒力因子，與福建泉州地區大腸桿菌高致死率71.43%（30/42） [14]具有一致性。徐引弟等通過對致病性大腸桿菌開展藥敏紙片試驗并對24個耐藥基因進行擴增分析，發現細菌耐藥決定區基因發生變異是引起細菌耐藥性的主要原因，進而從分子手段揭示了耐藥細菌株的基因型和表型具有一定關聯性，細菌產生多重耐藥性的機制具有較高的復雜性 [15]。因此，對于蘇淮豬可以參考從抗腹瀉基因MUC13、FUT1進行定向選育，利用分子育種方案從源頭上進行腹瀉的防控 [16]。

近年來，養殖業已經大力開始提倡減抗禁抗行動，但在疾病的預防治療、自配飼料的使用上，依然存在抗生素的濫用問題，致使細菌耐藥性問題日趨嚴重 [17-18]。本研究對分離獲得的致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌進行了12種抗菌藥的耐藥性分析，結果表明，大腸桿菌和沙門氏菌對林可霉素類和青霉素類高度耐藥，耐藥率均超過90%，除喹諾酮類外，其他抗菌藥均呈現不同程度的耐藥率。張青嫻等對分離的1株豬源產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌同樣對青霉素類、頭孢類、四環素類、喹諾酮類抗生素耐藥，而對氨基糖苷類抗生素敏感，并通過4種常見的ESBLs耐藥基因擴增分析，提出加強產酶耐藥菌的監測及保守地使用現有抗生素的觀點 [19]。而李佳瑞等從25株耐藥大腸桿菌攜帶的主動外排基因進行研究，acrA、acrB這2種主動外排基因和調控基因mar A和sox S的相對表達量和多重耐藥的耐藥譜數呈正相關，調控基因acrR的相對表達量和多重耐藥的耐藥譜數呈負相關 [20]。Xu等對我國北京等10個省份的動物、人的非典型致病性大腸桿菌（aEPEC）進行藥敏紙片試驗，結果顯示，267株菌株中，128株（47.9%）檢出多重耐藥，40株耐藥菌株對10種以上抗菌藥物耐藥，有47株（17.6%）菌株被鑒定為產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL），而從多重耐藥情況看，致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌多重耐藥情況嚴重，4耐及4耐以上菌株高達100% [21]，這一結果與Li等 [22]、田瑞 [23]研究基本一致，其中，Li等研究發現高達71.25%（57/80）的沙門氏菌菌株呈現多種藥物耐藥，對頭孢菌素類及氨基糖苷類抗生素敏感 [22];田瑞等研究的大腸桿菌分離率為86.31%（580/672），累計產生23種多重耐藥型 [23]。

4 結論

本研究從細菌性病原的角度對致蘇淮仔豬腹瀉的病因進行初步分析，發現大腸桿菌、沙門氏菌是主要致病菌，藥敏紙片試驗顯示2種致病菌均呈現4重及以上多重耐藥性，均對喹諾酮類藥物高度敏感，試驗結果可為蘇淮豬細菌性腹瀉癥的病因和臨床治療提供參考依據。

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