彌漫性大B細胞淋巴瘤治療中利妥昔單抗耐藥與Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α蛋白表達的相關性*

劉靜，鄧槿，顧季煒，馬欣玥，宋國齊，2b

(1.南通大學醫學院，江蘇南通226001；2.南通大學附屬醫院 a.檢驗科，b.血液科，江蘇南通226001)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常見的亞型，每年約占新診斷NHL病例的25%～35%，是一種高度侵襲性疾病，其免疫表型、遺傳學、臨床表現及預后都極具異質性[1-2]。目前，臨床使用的利妥昔單抗聯合環磷酰胺、蒽環類、長春新堿及潑尼松(R-CHOP)一線治療方案雖明顯改善了DLBCL患者的預后，但仍有部分包含雙打擊/三打擊(伴有MYC和BCL2/BCL6重排)的患者表現出對利妥昔單抗耐藥，預后差[3]。目前國內外對于雙打擊/三打擊淋巴瘤(DHI/THL)尚無統一、有效的治療方案。因此，了解利妥昔單抗獲得性耐藥的機制對于提高利妥昔單抗療效以及改善預后具有至關重要的意義。Smarcal1是一種DNA重塑蛋白質，它可以通過穩定、修復和重啟停滯的復制叉以應對MYC等癌基因誘導的DNA復制壓力。Puccetti等[4]發現，Smarcal1缺乏會減慢轉基因小鼠(Eμ-myc)淋巴瘤形成并提高生存率。B56-α及B55-α為PP2A調節亞基，研究發現，B56α-PP2A全酶在DT-061(SMAP)特異性結合下，可選擇性地對c-Myc去磷酸化，從而誘導細胞死亡和抑制腫瘤生長[5]。有學者還發現，Eya3可通過B55-α調控c-Myc中pT58去磷酸化過程促進腫瘤進展[6]。本研究擬參照Jazirehi等[7]的研究，采用“梯度加藥法”誘導DLBCL細胞系耐藥并進行驗證；檢測親本及耐藥細胞系中Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α蛋白表達變化；進一步干擾耐藥細胞系中Smarcal1、PP2A-B55-α的表達以及過表達PP2A-B56-α，評估其對利妥昔單抗敏感性改變。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 健康人血漿(南通大學附屬醫院體檢健康者)，RPMI-1640培養基及胎牛血清FBS(美國Gibco公司)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及CCK-8試劑盒(上海碧云天公司)，AnnexinV-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司)，利妥昔單抗注射液(上海羅氏制藥公司)，鼠抗人PP2A-B55-α單克隆抗體及PP2A-B56-α單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗人 Smarcal1單克隆抗體以及GAPDH單克隆抗體(美國 cell signaling technology公司)，sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α和oe-PP2A-B56-α 以及其陰性轉染對照(sh-NC、oe-vector)由廣州銳博生物科技公司設計及合成，LipofectamineTM2000 轉染試劑以及Trizol 試劑(美國Invitrogen公司)。酶聯儀(美國 Biotek公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，蛋白免疫印跡電泳設備及化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2細胞來源及培養 人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞系OCI-LY10、OCI-LY18均購自中國科學院細胞庫上海保藏中心，取上述生長狀態良好的細胞系，培養于含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度CO2培養箱中常規培養，每2～3 d換液1次，以1 000 r/min離心5 min,重懸于T75 cm培養瓶中，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3耐藥細胞系模型的建立 采用“梯度加藥法”誘導DLBCL細胞的耐藥：分別將處于生長對數期的DLBCL細胞系OCI-LY10、OCI-LY18以5×105/mL的細胞密度接種于含10%新鮮健康人血漿的RPMI-1640培養基中，加入0.5 μg/mL濃度利妥昔單抗，12 h后換完全培養基培養至細胞狀態恢復正常(約為4～5 d)，在下1個周期將利妥昔單抗的濃度提高至前1個周期的2倍，按此方式重復9個周期后，獲得對128 μg/mL利妥昔單抗耐藥的淋巴瘤細胞系。

1.4CCK-8法檢測細胞存活率 將親本及耐藥細胞系分別重懸于RPMI-1640完全培養基以及含10%新鮮健康人血漿RPMI-1640培養基中，分別接種于96孔細胞培養板中，每孔含細胞為5×104個，分別加入濃度為0、2、10、50 和100 μg/mL利妥昔單抗，每個樣本設3個復孔，溫育48 h后，按照CCK-8試劑盒說明書操作，在酶聯儀上檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=[A(加藥組)-A(空白組)]/[A(對照組)-A(空白組)]×100。采用SPSS 13.0軟件分析藥物的半數生長抑制濃度(IC50)值，并計算耐藥指數。耐藥指數(resistance index，RI)=耐藥株IC50/親本株IC50。

1.5流式細胞術檢測調亡 將親本及耐藥細胞系分別重懸于RPMI-1640完全培養基以及含10%新鮮健康人血漿RPMI-1640培養基中，每種細胞系均分為2組：control組(0 μg/mL利妥昔單抗組)和50 μg/mL利妥昔單抗組，每組設3個復孔，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養。48 h后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS沖洗2次，Binding buffer緩沖液重懸細胞，分別加入FITC-AnnexinV和PI染料各5 μL，避光溫育20 min， buffer緩沖液補足體積至500 μL。BD流式細胞儀檢測細胞凋亡率，采用BD分析軟件收集熒光信號，FlowJo軟件進行統計分析。細胞凋亡率=早期凋亡率(AnnexinV+/PI-)+晚期凋亡率(AnnexinV+/PI+)，實驗重復3次。

1.6總蛋白質提取及western blot 收集LY10及LY18的親本及耐藥細胞系，預冷PBS洗滌2次后加入RIPA 蛋白質裂解液，冰浴裂解提取總蛋白質，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液采用BCA法測定蛋白質濃度。按照制膠試劑盒說明書，取變性后蛋白質15 μL(30 μg)加入至125 g/L PAGE凝膠中(上層膠恒壓 80 V,恒壓120 V)，電泳結束后在300 mA恒壓條件下2 h將蛋白質轉移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h。加入鼠抗人PP2A-B55-α單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人PP2A-B56-α單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人Smarcal1單克隆抗體(1∶800稀釋)以及兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶800稀釋) 4 ℃溫育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，結束后分別加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)和HRP 標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)后室溫下避光溫育2 h，TBST洗膜5次，每次10 min，ECL化學發光法顯影后經化學發光成像系統曝光檢測目的條帶，Image J 4.1 軟件對條帶進行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件進行結果統計分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值，實驗重復3次。

1.7細胞轉染 將2株耐藥細胞重懸于含10%新鮮健康人血漿的RPMI-1640培養基中，接種于12孔細胞培養板，每孔含細胞為5×104個，按照LipofectamineTM2000說明書操作進行轉染，將2株耐藥細胞均分為sh-NC組(NC shRNA轉染組)、oe-vector組(vector oeRNA 轉染組)、sh-Smarcal1組(Smarcal1 shRNA轉染組)、sh-PP2A-B55-α組(PP2A-B55-α shRNA轉染組)及oe-PP2A-B56-α組(PP2A-B56-α oeRNA轉染組)，每組設置3個復孔，其中取1個復孔轉染24 h 后用于CCK-8法檢測(方法同1.4，向耐藥細胞及轉染后的耐藥細胞中分別加入0、2、10、50、100 μg/mL利妥昔單抗)，其余2個復孔細胞轉染48 h后用于驗證蛋白質表達。實驗重復3次。

1.8RNA提取、逆轉錄反應及實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 收集實驗1.7中轉染48 h后的細胞系(約5×106個)于1.5 mL無酶EP管中，各加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定總RNA濃度和比值(A260/280 nm為1.8～2.0)。取1 μg RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。樣本置于-20 ℃保存。采用RT-qPCR檢測各組sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α轉染耐藥細胞系前后的表達水平，根據NCBI參考序列Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α(分別為NC_000002.12、NC_000008.11、NC_000001.11)，由廣州銳博生物科技公司使用Primer Premier 5.0軟件設計及合成。Smarcal1上游引物序列：5′-AGGCCACAGTCCACGTAGT-3′,下游引物序列：5′-GCTGTTGTTTAGGGACCTCTGG-3′；PP2A-B55-α上游引物序列：5′-CCACCTTTATCTCCTGTTGC-3′，下游引物序列：5′-TTTCTCAGGTGAAAGGAGCAG-3′；PP2A-B56-α上游引物序列：5′-CGGGATCCATGTCGTCGCCGTCGCCGC-3′，下游序列：5′-CCGCTCGAGTTATTTGGCACTGGTACTGCTGCG-3′；GAPDH上游序列：5′-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，下游序列：5′-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′。PCR反應體系為20 μL，包括：10 μmol/L上、下引物各0.5 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 2 μL，DEPC水7 μL。PCR循環參數：95 ℃預變性10 min;95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個循環。利用StepOneTM軟件于62 ℃時進行熔解曲線分析。以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，ΔΔCt =(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內參基因)，每個樣本設置3個復孔并取平均值。

2 結果

2.1利妥昔單抗耐藥DLBCL細胞系鑒定結果 應用CCK-8法檢測耐藥細胞系的存活率結果表明，在0、2、10、50 和100 μg/mL的利妥昔單抗作用下，LY10及LY10RR細胞的IC50分別為(0.91±0.07) μg/mL和(287.40±26.30) μg/mL，耐藥指數為315.58；LY18及LY18RR細胞的IC50分別為(4.73±0.24) μg/mL和(532.10±37.95) μg/mL，耐藥指數為112.41，二者差異有統計學意義(t值分別為10.51和15.18，P均<0.001)。各細胞系細胞存活率結果見圖1。

注：A，LY10及LY10RR細胞存活率；B，LY18及LY18RR細胞存活率。

2.2利妥昔單抗處理親本與耐藥細胞系的凋亡差異 50 μg/mL利妥昔單抗處理48 h后，LY10RR和LY18RR細胞的凋亡率分別為(7.28±1.25)%、 (6.41±1.46)%，與對照組LY10RR和LY18RR細胞的凋亡率分別為(4.94±0.79)%、(4.07±1.35)%相比，差異均無統計學意義(t值分別為2.86和2.90，P值分別為0.06和0.05)，而利妥昔單抗處理48 h后，LY10和LY18細胞的凋亡率分別為(30.42±5.52)%、(26.46±2.34)%，與對照組LY10和LY18細胞的凋亡率分別為(4.09±0.73)%、(3.21±0.32)%相比，差異有統計學意義(t值分別為10.50和9.86，P均<0.001)。見圖2。

注：A、B，LY10RR以及利妥昔單抗處理LY10RR 48 h后的凋亡比率；C、D，LY10以及利妥昔單抗處理LY10 48 h后的凋亡比率；E、F，LY18RR以及利妥昔單抗處理LY18RR 48 h后的凋亡比率；G、H，LY18以及利妥昔單抗處理LY18 48 h后的凋亡比率。

2.3western blot檢測 Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α蛋白在親本與耐藥 DLBCL 細胞系中的表達情況 結果顯示，與親本細胞相比，在發生利妥昔單抗耐藥細胞系中，Smarcal1和PP2A-B55-α表達量均增加，PP2A-B56-α表達水平下降，且差異均具有統計學意義(P均<0.05)。見表1、圖3。

表1 western blot檢測Smarcal1、 PP2A-B55-α及PP2A-B56-α在親本和耐藥細胞系中的表達

圖3 western blot檢測Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α在親本及耐藥 DLBCL 細胞系中的表達

2.4RT-qPCR檢測耐藥細胞系sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α的轉染效率 結果表明，相對于sh-NC組(均為1.00±1.00)，sh-Smarcal1組LY10RR和LY18RR耐藥細胞系中Smarcal1的表達水平均明顯下調(分別為0.45±0.05、 0.41±0.07)，差異均有統計學意義(t值分別為10.50、8.56，P均<0.01)；sh-PP2A-B55-α組中PP2A-B55-α的表達水平均明顯下調(分別為 0.51±0.05、0.45±0.06)，差異均有統計學意義(t值分別為10.05、9.39，P均<0.01)；相對于oe-vector組(均為 1.00±1.00)，oe-PP2A-B56-α組中PP2A-B56-α的表達水平明顯上調(分別為2.33±0.13、3.067±0.23)，差異有統計學意義(t值分別為10.05、8.86，P均<0.01)。

2.5轉染后耐藥細胞對利妥昔單抗耐藥性的影響 轉染后的LY10RR和LY18RR在2、10、50 和100 μg/mL的利妥昔單抗刺激48 h后，經CCK-8法檢測結果顯示，sh-Smarcal1組的細胞活力明顯低于sh-NC組(F值分別為226.9和67.1，P<0.01)，sh-PP2A-B55-α組的細胞活力明顯低于sh-NC組(F值分別為592.7和377.2，P<0.01)，oe-PP2A-B56-α組的細胞活力明顯低于oe-vector組(F值分別為734.5和219.9，P<0.01)。見表2、圖4。

表2 CCK8法檢測不同濃度利妥昔單抗處理不同細胞系的細胞存活率

注：A，CCK-8法檢測不同濃度利妥昔單抗對轉染sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α后LY10RR細胞活力的影響；B，CCK-8法檢測不同濃度利妥昔單抗對轉染 sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α后LY18RR細胞活力的影響。

3 討論

Puccetti等[4]通過持續調控MYC失調，產生慢性復制應激，從而誘導B細胞淋巴瘤形成，證實了Smarcal1的雙等位基因失活可抑制腫瘤的進展，提示惡性腫瘤可能依賴于Smarcal1以穩定復制叉并完成復制。在本研究中，成功構建了穩定的利妥昔單抗耐藥的“雙重打擊”淋巴瘤衍生細胞系LY10RR和LY18RR，并發現在耐藥株中Smarcal1表達量明顯增加；而進一步干擾Smarcal1表達后，發現利妥昔單抗對耐藥細胞系的細胞毒作用均增強。這與Puccetti等[4]的研究結果較為一致，均證實抑制Smarcal1可延緩淋巴瘤形成。但本實驗還進一步證實了Smarcal1與DLBCL治療中利妥昔單抗耐藥相關。

MYC基因和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)的失活是癌癥中常見的2種類型，該2種蛋白質均為細胞增殖、凋亡和分化的重要調節因子，它們直接或間接調節彼此的生物活性。研究表明，針對MYC/PP2A通路是臨床上可行的治療策略[8]。PP2A的特定功能通常由其包含的特定調節亞基——B亞基控制。Leonard等[5]研究發現，DT-061(SMAP)可以特異性穩定B56α-PP2A全酶，使后者可選擇性的對底物c-Myc等去磷酸化，從而誘導細胞死亡和抑制腫瘤生長。Zhang等[6]研究發現，Eya3可通過PP2A的B55-α亞基控制c-Myc基因的pT58位點發生去磷酸化，從而促進腫瘤的進展。在本研究中發現耐藥株中PP2A-B55-α表達量增加以及PP2A-B56-α表達量下降；進一步在2株耐藥細胞中分別干擾PP2A-B55-α和過表達PP2A-B56-α，發現利妥昔單抗對LY10RR和LY18RR的細胞毒作用均增強。本研究結果與Leonard等[5]和Zhang等[6]的研究結果類似，均證實了在彌漫大B細胞淋巴瘤中抑制PP2A-B55-α蛋白的表達或增強PP2A-B56-α蛋白表達會增強其對利妥昔單抗的敏感性。因此，筆者認為Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α均可導致MYC基因失調，促進細胞的增殖，從而在利妥昔單抗耐藥形成過程中發揮重要作用。然而，本研究僅檢測上述3種蛋白質在利妥昔單抗耐藥前后DLBCL細胞中的表達水平變化，對其下游的相互作用靶點尚未確定。今后還需要進一步深入的研究來闡明其在腫瘤發生、發展過程中的分子機制，以確認Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α作為利妥昔單抗耐藥DLBCL治療和診斷靶點的潛能。