血清miR-211對糖尿病視網膜病變的診斷價值及其影響因素分析

劉琪，王紹飛，丁琳，秦艷莉，麥迪娜·那畢江

(新疆維吾爾自治區人民醫院眼科,烏魯木齊 830001)

2型糖尿病是一種內分泌代謝性疾病，糖尿病視網膜病變(DR)是其常見的并發癥之一，屬于嚴重的全身微血管并發癥[1]。早期研究多認為，DR的發病機制與血管內皮功能損傷、糖基化末端產物及高糖應激損傷等機制有一定的關系[2]。近年來研究顯示，微小RNA(miRNA)參與了細胞的增殖、分化和凋亡等生理過程，且在血管病變中起到關鍵性作用，并進一步證實其對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信號通路的傳導過程產生影響[3]。有學者證實，miR-211在糖尿病及眼部并發癥進展過程中具有重要作用，高糖環境下其表達水平會顯著增加[4]，但是其表達水平對DR影響的機制尚不明確。因此，本研究旨在檢測并評估血清miR-211對DR的診斷價值，并對其影響因素進行分析。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2018年12月至2020年10月新疆維吾爾自治區人民醫院眼科收治的DR患者90例作為DR組，男46例，女44例，年齡(65.93±9.92)歲，并進一步分為增生型糖尿病視網膜病變(PDR，n=31)和非增生型糖尿病視網膜病變(NPDR，n=59)。納入標準：原發性2型糖尿病且病程不低于2年；所有患者均符合2014版DR臨床診療指南標準中關于DR的診斷標準[5]，未接受抗DR的相關治療；屈光介質及眼壓正常；臨床資料完整。排除標準：近期有創傷史及手術史；伴有全身惡性腫瘤、肝腎功能障礙及心腦血管嚴重病變患者；伴有青光眼、白內障、視神經疾病及視網膜靜脈阻塞等其他眼部疾病患者；患有糖尿病的其他并發癥患者；伴有急性或慢性感染患者；伴有甲狀腺功能亢進及庫欣綜合征等對糖代謝造成影響的疾病患者；伴有自身免疫系統疾病患者；長期使用抗精神疾病類藥物或糖皮質激素類藥物患者；哺乳期或妊娠期婦女；無法配合眼科檢查患者；臨床資料不完善患者。選擇本院同期收治的單純2型糖尿病患者(未合并DR)45例作為NDR組，均符合中國2型糖尿病防治指南中2型糖尿病診斷標準[6]，男21例，女25例，年齡(65.89±9.87)歲。另選同期在本院進行體檢的健康受試者45例作為健康人對照組，男23例，女23例，年齡(66.01±10.22)歲。各組受試者的基本資料見表1。本研究經新疆維吾爾自治區人民醫院醫學倫理學委員會審核批準(批準文號：LY-2018-03)，受試者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器 VEGF雙抗體夾心酶聯免疫吸附試劑盒(美國R&D公司)，DEPC水(天根生化科技公司)，Trizol LS試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)，氯仿、乙酸、乙醇(中國國藥集團化學試劑公司)，RNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)，二甲亞砜(DMSO，美國Sigma-Aldrich公司)，逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。低溫、低速離心機(德國Heracus公司)，超低溫冰箱(日本Sanyo公司)，紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，CFX96型熒光量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集所有受試者入組時(體檢健康者于體檢時采集)及餐后2 h空腹肘靜脈血4 mL于非抗凝采血管中，室溫靜置30 min，4 ℃、1 200 r/min離心10 min，取上清液500 μL分裝于1.5 mL無菌Eppendorf管中，置于-80 ℃保存。另采集各組空腹外周靜脈血3 mL于非抗凝采血管中，5 000 r/min離心5 min后取上清備用。

1.3.2RNA提取及逆轉錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 取上述各組的血清標本500 μL，按照Trizol LS試劑說明書提取總RNA，并根據RNA純化試劑盒說明書對RNA進行純化，采用紫外分光光度計檢測其吸光度(A260/280 nm)，取比值為1.8～2.0的樣本用于后續試驗，并置于-80 ℃保存。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。miR-211及U6引物設計與合成均由上海生工公司完成。 miR-211上游引物序列：5′-TCGGCAGGTCCCTTTGTCATCC-3′，下游引物序列：5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。 PCR總反應體系為25.0 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ExTaq酶0.25 μL，ddH2O補足體積至25 μL。循環參數：94 ℃預變性5 min ；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸10 min， 28～36個循環；4 ℃保存。采用CFX96型熒光定量PCR儀配套軟件于61 ℃時采集熒光信號，以U6為內參照，采用=2-△△Ct法計算miR-211的相對表達量。每個樣本設3個復孔，取均值。

1.3.3VEGF水平測定 取上述各組上清標本50 μL，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中VEGF的表達水平，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書操作及結果判讀。

2 結果

2.13組受試者臨床資料比較 3組受試者的年齡和性別等基本資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，但空腹血糖、糖化血紅蛋白比較差異有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較結果表明，DR組和NDR組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白的表達水平均顯著高于健康人對照組(P<0.05)，且DR組亦高于NDR組(P<0.05)。結果見表1。

表1 3組受試者臨床資料比較結果

2.23組受試者血清VEGF水平及血漿中miR-211表達量的比較 3組受試者血清VEGF水平及miR-211相對表達量比較差異具有統計學意義(P<0.05)；組間兩兩比較結果表明，NDR組和DR組患者血清VEGF水平和miR-211的相對表達量均顯著高于健康人對照組，且DR組高于NDR組(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者血清VEGF水平及miR-211相對表達量的比較

2.3不同分期DR患者血糖指標、血清VEGF水平及miR-211相對表達量比較 PDR組患者血清VEGF水平、miR-211相對表達量、糖化血紅蛋白和空腹血糖水平均顯著高于NPDR組(P<0.05)。見表3。

表3 不同分期DR患者血糖指標、血清VEGF水平及miR-211相對表達量比較

2.4DR患者血漿miR-211相對表達量的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析結果顯示，性別和年齡不是DR患者血漿miR-211相對表達量的影響因素；但DR分期、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF及病程均是DR患者血漿中miR-211相對表達量的影響因素。見表4。

表4 DR患者血漿中miR-211相對表達量的影響因素分析

2.5DR患者血漿miR-211相對表達量與糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平的相關性分析 相關性分析結果顯示，DR患者糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平與miR-211的相對表達量均呈正相關(r值分別為0.879、0.763、0.775，P均<0.001)。

2.6ROC曲線評估miR-211診斷DR的效能 采用ROC曲線評估miR-211對DR的診斷效能，將DR組賦值1，NDR組和健康人對照組賦值0，結果顯示， miR-211診斷DR的ROC曲線下面積(AUCROC)及95%CI分別為0.839(95%CI:0.785～0.894，P<0.001)，當cut-off值為2.23時，其敏感性和特異性分別為72.4%和75.0%。

3 討論

DR作為糖尿病微血管并發癥之一，是損害視功能甚至造成失明的重要原因，DR的發生、發展過程與miRNA及VEGF基因的調控關系密切[7]。miRNA可以特異性作用于靶基因序列，在轉錄水平后對基因的表達進行調節，進而在多種生物學過程中發揮作用[8]。血液循環中的miRNA是理想的生物學標志物之一，具有穩定性高、靈敏度高、易獲取及非入侵性等特點，其表達水平的異常改變較其所調控的蛋白質表達改變時間上更早，在糖尿病患者尚未出現視網膜病變時其表達水平已出現異常[9]。研究證實，miRNA在心臟病及糖尿病腎病等糖尿病血管并發癥中可反映病變組織的病理變化，是有效的生物學標志物[9]。DR進展過程中造成的視網膜血管內皮損傷可使細胞中miRNA大量滲漏進入循環系統，從而引起血清中miRNA水平升高[10]。

有學者證實，miR-211表達于人類各種眼組織中，與糖尿病及眼部并發癥密切相關，高糖環境中miR-211表達顯著增加，對細胞的凋亡具有促進作用，且可對細胞增殖造成抑制，引起組織缺氧、缺血及細胞功能受損，致使組織失去活性[11]。本研究結果顯示，DR患者血漿miR-211的表達水平及血清VEGF水平均顯著高于單純2型糖尿病患者及健康受試者，且PDR患者血漿miR-211的表達水平及血清VEGF水平亦顯著高于NPDR患者，分析原因可能為高表達的miR-211對視網膜血管微環境中的視網膜內皮細胞的凋亡具有促進作用，破壞視網膜血管的結構，增加通透性，進而使miR-211表達水平增加[12]。

本研究結果還顯示，DR分期、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF及病程對DR患者血漿miR-211的相對表達量均有一定的影響作用，且DR患者糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平與miR-211的相對表達量均呈正相關。由于血糖控制不佳會造成DR病情加重，糖化血紅蛋白可有效反饋血糖的控制水平，作為晚期糖基化的一種產物，其濃度的增加及大量的沉積會使糖基化中的膜產物受體表達被激活，促進氧自由基的釋放，引起組織缺氧，增加血管的通透性，誘發形成新生血管，使DR病情加重[13]。VEGF在促進血管生成中具有關鍵性作用，可直接影響新血管生成及血管通透性，與DR疾病進展關系密切。血糖控制不佳會引起miR-211表達水平增加，損害血管內皮，影響血管內皮功能，從而加重DR病情[14]。此外，本研究還通過ROC曲線分析證實，血漿miR-211的表達水平對DR具有較高的臨床診斷效能。

綜上所述，DR患者miR-211表達水平顯著高于單純2型糖尿病患者及健康受試者，且受DR分期、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF及病程影響，并與糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平呈正相關，對DR具有較高的診斷效能，后續研究中我們將會擴大樣本量，并納入民族、地域等因素，進一步對miR-211在視網膜病變中的作用機制進行研究。