牦牛GHR基因部分片段SNP多態對乳成分影響的研究

金鑫燕

(青海大學畜牧獸醫科學院，西寧 810016)

生長激素受體 (growth hormone receptor，GHR)是眾多被認為影響泌乳性能候選基因中影響泌乳性狀較多的一個基因,牛GHR基因位于20號染色體，由10個exon和9個子intron組成，基因序列SNP突變會使該基因結構和功能發生改變，從而影響信號轉導及該基因介導的生長激素(growth hormone，GH)基因的生理效應[1]，最終使泌乳、生產等經濟性狀發生改變。將牛GHR基因作為候選基因，研究該基因與泌乳、生產性能的關系，對牛的育種具有重大實踐意義[2]。國內外大量研究發現，GHR基因第8exon T/A替換，使其編碼的氨基酸呈現F279Y轉換，顯著影響牛的泌乳性能[3-7]。也有研究表明，GHR基因部分外顯子多態產生的不同基因型對乳脂率[8、9]、乳蛋白百分含量[10]有影響。本研究對青海澤庫高原型牦牛GHR基因部分片段進行了SNP多態性檢測，結合乳成分數據分析了該SNP多態對乳成分的影響，旨在為下一步針對牦牛乳選育提高提供一定的分子遺傳學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物來自青海省澤庫縣某牧場，采集32頭(胎次為2～3胎，年齡為6～7歲，產犢時間為當年4月底到5月初)泌乳牦母牛頸靜脈血樣5mL，干冰運往實驗室，-20℃冷凍保存。

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA提取采用柱式血液基因組DNA抽提試劑盒(生工)。提取后DNA采用分光光度計檢測濃度和純度。

1.3 引物序列及PCR反應程序

PCR引物設計參照NCBI 中登錄號為AM161140.1序列。

表1 牦牛GHR基因片段 1、2、exon 8 擴增引物序列

PCR反應體系：DNA模板2μL，引物F、R 各2μL，dNTP 2μL，10×Taq buffer 5μL，Taq酶 0.5μL，加ddH2O至50μL。

PCR反應條件：95℃預變性4min；94℃變性30 sec，55℃退火30sec，72℃延伸50 sec；35 cycle，72℃修復延伸6 min。

1.4 PCR產物回收測序

PCR產物切膠后經PCR產物回收試劑盒回收后冷凍，冷凍樣品干冰送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序及檢測SNP。

1.5 乳成分數據測定

乳樣采集時間為7月底純放牧條件下，采集50ml泌乳牦母牛奶樣干冰運往實驗室，用超聲波乳品分析儀檢測乳脂肪、乳蛋白、非脂乳固體、密度、冰點、鹽、電導率。

1.6 數據分析

數據統計軟件采用IBM SPSS Statistics 22，分析各乳成分的平均值和標準偏差及SNP產生不同基因型組各乳成分差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 牦牛GHR基因部分片段PCR擴增結果

引物1擴增片段1長度為635bp，引物2擴增片段2長度為772bp，引物3擴增Exon 8片段長度為470bp。

2.2 牦牛GHR基因部分片段SNP多態性檢測結果

本試驗所有樣本中未發現片段1、exon 8 SNP多態性，片段2發現多態位點1個，第82位T。

2.3 CC型和CT型各乳成分平均值比較

CC型和CT型占比為3∶1，CT型各乳成分含量平均值比CC型較高。CC基因型和CT基因型兩組平均數采用配對樣本T檢驗法比較差異顯著性，結果表明，不同基因型間冰點值P<0.05，說明CC基因型和CT基因型間冰點值差異顯著，CC基因型冰點值顯著高于CT型，CC型為該群體優勢基因型。其它乳成分不同基因型間差異不顯著。

表2 不同基因型間牦牛乳成分均值及差異顯著性比較

3 討論與結論

(1)對中國荷斯坦牛GHR基因第8 exon F279Y位點SNP與泌乳性能的相關性研究發現，該SNP與305d泌乳量、乳脂率和乳蛋白率顯著相關[11]。馬彥男等[12]研究表明，該位點突變形成的AA基因型305d泌乳量顯著高于AT基因型，而AT基因型在305d乳脂量、305d乳蛋白含量和305d乳糖量高于AA基因型，等位基因A對高產奶量有正效應，等位基因T對乳成分有正效應，并表明該F279Y突變可針對性應用于中國荷斯坦牛泌乳性狀的標記輔助選育中。然而在本試驗中未發現牦牛GHR基因第8 exon F279Y位點突變，可能是樣品數量較少的原因，該位點在牦牛群體中是否存在突變有待進一步研究。

(2)生乳冰點是衡量生乳中是否添加水的重要指標之一[13]。20世紀初，冰點被正式應用于牛乳中摻水鑒定[14]，檢測儀器最早利用Hortvet冰點儀進行[15]。隨著科技的發展，現在已研制出多種冰點儀[16]。鑒于冰點儀在技術上的持續優化、奶牛飼養管理、擠奶方式、產奶量等變化，普通牛乳中正常冰點值范圍也一直是研究熱點。20世紀60年代 Stubbs[17]、Dahlberg[18]、Hortvet測定的普通牛乳冰點均值低于-0.540℃，20世紀90年代各國研究冰點值范圍為-0.530～-0.520℃[19]，現在普遍認同的荷斯坦牛乳冰點均值為-0.525～-0.521℃[20]。研究表明[21]品種差異、個體差別、季節變化、乳房炎、飼養管理條件等因素均會影響牛乳冰點值。目前對冰點值的研究大多局限于普通荷斯坦牛乳，有關牦牛乳冰點值方面的研究報道極為罕見。對牦牛乳冰點值也沒有統一標準可參考，且各地方品種和類群牦牛間乳成分差異較大，研究牦牛乳的冰點值能為今后牦牛生鮮乳收購標準的制定提供重要的理論依據。研究表明牦牛乳冰點與乳糖、乳蛋白、非脂乳固體呈極顯著負相關[22]。該結論與李玲等[23]對水牛乳冰點值與滴定酸度、蛋白質、脂肪、總固形物以及乳糖+灰分總量存在極顯著負相關性的結論相同。

(3)有關牦牛GHR基因對泌乳性能影響的研究報道極為少見，對該基因的研究僅限于該基因在牦牛不同組織中的表達及對生長性狀影響的研究[24]。對麥洼牦牛GHR基因SNP多態性研究發現第5exon存在一個SNP位點，該SNP位點形成3種基因型TT/TC/CC，TT基因型管圍極顯著高于TC和CC基因型，TC和CC基因型差異不顯著，CC為優勢基因型[25]。本試驗所測片段2SNP位點產生的CC基因型冰點值顯著高于CT基因型，CC型為該群體優勢基因型。再結合冰點與其它乳成分的極顯著相關性，是否可由此針對性的開展分子育種有待進一步研究。