參芪解郁方對母嬰分離產后抑郁大鼠磁共振波譜的干預作用研究

王岳青　曲淼　茹塵　鄧璐瑤　謝穎楨

〔摘要〕 目的 通過應用磁共振波譜（magnetic resonance spectroscopy， MRS）觀察母嬰分離產后抑郁大鼠腦組織內代謝物的濃度，探索參芪解郁方對母嬰分離產后抑郁大鼠模型的干預作用。方法 SD孕鼠72只，孕16 d，隨機分為正常組、模型組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組，共4組，每組18只，模型組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組，采用母嬰分離法制備產后抑郁大鼠模型，在產后1～21 d每日分離4 h。造模結束后，分別給予雙蒸水、參芪解郁方、鹽酸氟西汀灌胃，正常組給予等容雙蒸水灌胃，再設1、2、4周3個時點，分別對大鼠進行行為學測試，并于第4周采用MRS定量檢測技術掃描各組大鼠雙側海馬、前額葉皮質的N-乙酰天冬氨酸（N-acety1 aspartate， NAA）、含膽堿化合物（choline， Cho）、肌醇（myo-inositol， mI）、肌酸（creatine， Cr）以及谷氨酸（glutamate， Glu），測定NAA、Cho、G1u及mI相對濃度變化，計算NAA/Cr、Cho/Cr、Glu/Cr及mI/Cr的比值。結果 行為學結果：與正常組相比，模型組大鼠各時點的不動時間均明顯增加（P<0.01），掙扎時間、游泳時間、曠場實驗總分、蔗糖水消耗、進入開放臂的次數比例（OE/TE）和進入開放臂的時間比例（OT/TT）明顯降低（P<0.01）;與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組大鼠各時點的不動時間明顯減少（P<0.01）;掙扎時間、游泳時間、曠場實驗總分、蔗糖水消耗、OE/TE和OT/TT明顯升高（P<0.01）。MRS結果：與正常組相比，模型組大鼠雙側前額葉皮質、海馬的NAA/Cr、Cho/Cr明顯降低（P<0.01），Glu/Cr明顯升高（P<0.01）;與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組大鼠雙側海馬NAA/Cr、Cho/Cr值顯著升高（P<0.01）。結論 參芪解郁方可以調節母嬰分離PPD模型大鼠的抑郁樣行為，修復PPD受損神經元，促進神經重塑，調節谷氨酸能系統及膜磷脂代謝，從而對PPD發揮治療作用。

〔關鍵詞〕 母嬰分離;產后抑郁;磁共振波譜;參芪解郁方

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.003

〔Abstract〕 Objective To observe brain metabolites changes in rats with maternal and infant separation post-partum depression （PPD） and effects of Shen-Qi-Jie-Yu-Fang （SJ Fang） on maternal and infant separated PPD rat model by magnetic resonance spectroscopy （MRS）. Methods 72 pregnant SD rats on the 16th day of pregnancy were randomly divided into four group， normalgroup， model group， SJ Fang group and fluoxetine group， and with 18 rats in each group. Model group， fluoxetine group， and SJ Fang group were created in SD rats by suffered with maternal infant separation stress （MISS）. They were separated daily for 4 hours from 1 to 21 day postpartum. After the modeling， rats were given intragastric administration with SJ Fang， fluoxetine and distilled water， normal group was given equal volume double distilled water. Behavioral tests were conducted at 3 time points at 1st， 2nd， 4th week， respectively. At the 4th week， the N-acety1 aspartate （NAA）， choline （Cho）， myo-inositol （mI）， creatine （Cr） and glutamate （Glu） in the bilateral hippocampus and prefrontal cortex of rats in each group were scanned by MRS quantitative detection technology. Changes in the relative concentrations of NAA， Cho， G1u and mI were determined， and the ratios of NAA/Cr， Cho/Cr， Glu/Cr and mI/Cr were calculated. Results Behavioral results： compared with the normal group， the immobility time of model group was significantly increased at each time point （P<0.01）， while the struggle time， swimming time， total score of open field experiment， sucrose water consumption， the proportion of times entering the open arm （OE/TE） and the proportion of open entries/total entries （OT/TT） were significantly decreased （P<0.01）; compared with model group， both fluoxetine group and SJ Fang group decreased immobility time （P<0.01）， increased swimming time， struggling time， sucrose consumption， OT/TT and OE/TE （P<0.01）. MRS results： compared with normal group， NAA/Cr， Cho/Cr in bilateral prefrontal cortex and hippocampus of model group were significantly decreased （P<0.01）， and Glu/Cr was significantly increased （P<0.01）; compared with model group， the values of NAA/Cr and Cho/Cr in bilateral hippocampus of rats in SJ Fang group and fluoxetine group were significantly increased （P<0.01）. Conclusion SJ Fang could regulate the depression-like behavior of maternal and infant separation PPD model rats， repair PPD damaged neurons， and promote neural remodeling， regulate glutamatergic system and membrane phospholipid metabolism， and thus play a therapeutic role in PPD.

〔Keywords〕 maternal and infant separation; post-partum depression; magnetic resonance spectroscopy; Shen-Qi-Jie-Yu-Fang

產后抑郁癥（postpartum depression， PPD）是與分娩相關的暫時性重度抑郁癥發作，是全球范圍內女性常見的精神心理問題之一，其發病率約為13%～19%[1]。有相關研究[2]已經證實，PPD直接影響產婦的生活質量，如果不及時治療，可使產婦出現精力下降、注意力不集中、睡眠障礙，甚至影響母嬰關系，嚴重者誘發產婦殺嬰和自殺。因此，了解PPD的病理生理過程具有重要意義。

磁共振波譜（magnetic resonance spectroscopy， MRS）作為一種無創性的功能影像技術，可以測量腦組織內多種代謝物的水平，對大腦功能進行定性及定量分析，課題組前期[3-4]采用MRS對腦卒中后抑郁和廣泛性焦慮大鼠腦內形態學進行探索性研究兩種模型的大鼠均存在腦組織形態學的改變及神經元的損傷，相比之下，采用MRS技術研究PPD尚處于早期階段，PPD發病與腦內代謝物濃度的改變有待進一步研究。因此，本研究以腦代謝水平為切入點，采用母嬰分離法制備產后抑郁大鼠模型，以中藥參芪解郁方為干預手段，利用MRS技術定量分析PPD大鼠前額葉皮質和海馬腦組織內的相關能量代謝物，揭示PPD大鼠的腦功能變化，并以補益心脾方藥參芪解郁方對PPD大鼠進行干預，從大鼠腦代謝水平及不同時間點的行為學等相關指標，闡釋參芪解郁方對PPD大鼠的干預機制，為臨床提供治療思路和理論依據。

1 實驗材料

1.1? 實驗動物

采用SPF級，Sprague-Dawley孕鼠，孕16 d購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物許可證：SCXK（京）2016-0006]。母鼠僅在懷孕期間給予繁殖營養飼料，產后則給予普通飼料。實驗過程中動物自由攝食和飲水（蔗糖水消耗實驗除外），室內安靜，光照周期為12 h（7：00～19：00），室溫 20～22 ℃，相對濕度為60%～70%。

1.2? 實驗藥物

參芪解郁方由黨參12 g、黃芪20 g、炒棗仁 30 g、當歸15 g、郁金15 g、山茱萸肉30 g、陳皮 10 g、佛手9 g組成[4]。參芪解郁方中藥配方顆粒購于北京中醫藥大學第三附屬醫院，按成人用量7倍計算大鼠用量，生藥配比1.25 g/mL，溶于雙蒸水，于4 ℃冰箱貯存備用，臨用前加熱。鹽酸氟西汀膠囊購買于禮來蘇州制藥有限公司（20 mg×7粒，批號：0943A），60 kg體質量成人用量20 mg/d，按成人用量的7倍計算大鼠每天用量為0.25 g/100 g，臨用時溶于雙蒸水中，濃度為0.25 mg/mL。

2 實驗方法

2.1? 動物分組與造模

孕16 d SD大鼠，單籠飼養，購入后適應性喂養3 d，3 d后進行曠場測試，根據評分結果篩選72只合格孕鼠，并隨機分為正常組、模型組、參芪解郁方組和鹽酸氟西汀組，共4組。每組再設處理后第1、2、4周觀察時間點，各組不同時間點設大鼠6只。

造模方法參照實驗進行，采用母嬰分離應激法制備動物模型[5-6]，于分娩后第1天至第21天進行母嬰分離，每天分離4 h，分離時間為每天上午9：00 至下午1：00，分離時將幼鼠移至另一籠中，分離結束后將幼鼠放回對應母鼠籠子中，對照組幼鼠不做任何處理，所有幼鼠于第22天斷乳。造模后1、2、4 周觀察模型組與正常組行為學變化，明確造模成功。

2.2? 給藥方法

于造模結束后進行藥物干預，以相當于成人用量的7倍計算，配成419 mg/kg的混懸液（即1劑配方顆粒加100 mL的蒸餾水）藥物灌胃體積為1 mL/100 g體質量。參芪解郁方組給予自擬參芪解郁方（該方已提交專利申請，專利號201810157146.5）中藥配方顆粒，鹽酸氟西汀組予鹽酸氟西汀膠囊，正常組和模型組給予等容雙蒸水。母鼠灌胃1、2、4周進行行為學實驗，灌胃結束后行影像學檢測。

2.3? 行為學測試

2.3.1? 大鼠體質量增長情況? 實驗開始后，每周監測大鼠體質量，并計算大鼠灌胃1、2、4周的體質量增長情況，根據體質量情況調整藥物劑量。

2.3.2? 強迫游泳實驗? 強迫游泳（forced swimming test， FST）實驗參照文獻[7-8]進行，第1天，將各組大鼠在安靜狀態下分別置于直徑25 cm、高度60 cm、水深35 cm的圓柱形缸內進行預游泳，時間15 min，水溫24～25 ℃。結束后，用毛巾擦干鼠毛，將大鼠置于28 ℃的環境中30 min后放回鼠籠。第2天同一時間（24 h后）進行強迫游泳正式實驗，在同一時間、同樣條件下讓待測大鼠游泳5 min，并記錄5 min內大鼠呈現的不動狀態、掙扎狀態、游泳狀態的時間，以秒（s）為單位。FST在一定程度上反映了大鼠的抑郁狀態。

2.3.3? 曠場實驗? 曠場試驗（open field test， OFT）參照文獻[9-10]進行，實驗裝置為曠場箱（100 cm×100 cm×40 cm），四壁涂黑，記錄動物穿越方格次數作為水平活動得分，以動物兩前肢離地次數作為垂直活動得分，將大鼠放入敞箱中央，記錄5 min內大鼠水平活動與垂直活動得分。最后將水平得分和垂直得分相加，記錄為曠場試驗的總分。

2.3.4? 蔗糖水消耗實驗? 參照文獻[11-12]進行，實驗前，大鼠禁食禁水24 h，24 h后給予各組大鼠1%的蔗糖水，并計算1 h內每只大鼠自由飲用1%蔗糖水的消耗量。用測量前水瓶液體的體質量減去測量后水平液體的體質量，得出的差值即為蔗糖水消耗量。

2.3.5? 高架十字迷宮實驗? 高價十字迷宮（elevated plus-maze， EPM）是一種經典的非條件性焦慮測試，被廣泛用于焦慮相關神經生物學中。參照Marchette等人[13]報道的方法將大鼠面朝閉合臂輕放于中央平臺，測試時間5 min，觀察指標：進入開放臂的次數（open-arm entries， OE）、時間（open-arm time， OT）和進入閉合臂的次數和時間。計算出OE占進入兩臂總次數（total entries， TE）的百分比OE/TE和0T占在兩臂中停留的總時間（total time， TT）的百分比OT/TT。

2.4? MRS測定

2.4.1? 動物準備? 動物腹腔麻醉下，俯臥位置于掃描床上，頭部固定，在大鼠軀干覆蓋棉布保溫，連接呼吸監控接收裝置。掃描過程中保持室內溫度在20～22 ℃，同時監測大鼠的呼吸頻率，使其保持在70～80次/min之間。

2.4.2? 磁共振波譜測定? 在雙側海馬及雙側前額葉皮質部位，分別選擇一3 mm×3 mm×3 mm大小的立方體感興趣區，因為有臨床和神經影像學證據證據表明抑郁癥患者這一區域的功能神經化學發生了改變[14-15]，經勻場和抑水后，采用PRESS序列采集1H譜，譜寬1 500 Hz，采樣點數2 048，TR=2 500 ms，TE=20 ms，累加次數500次，所得1H譜經傅立葉變換，基線校正后，指定水峰的化學位移為4.77 ppm，從而確定2.02 ppm的N-乙酰天冬氨酸（NAA）、3.0 ppm的肌酸（Cr）、3.22 ppm的膽堿化合物（Cho）、2.35 ppm的谷氨酸（Glu）及3.56 ppm的肌醇（mI）等信號。測定這些譜峰的高度，計算NAA/Cr、Cho/Cr、Glu/Cr、MI/Cr。

2.5? 統計學處理

采用統計軟件SPSS 26.0及Graphpad prism 8.0進行統計分析處理，所得數據以“x±s”表示。計量資料先進行正態性檢驗，符合正態分布且方差齊時，多組組間比較采用one-way ANOVA檢驗分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。不符合正態分布者進行數據轉化使其符合正態分布或采用非參數檢驗。顯著性水準取α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠產后體質量比較

在灌胃1、2、4周后，與正常組相比，模型組大鼠體質量明顯下降（P<0.05）。灌胃1周后，與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組體質量增加，但差異無統計學意義（P>0.05）;治療2周后，參芪解郁方組與模型組相比較，差異有統計學意義（P<0.01），鹽酸氟西汀組與模型組相比較差異無統計學意義（P>0.05）;治療4周后，參芪解郁方組與模型組相比較，差異有統計學意義（P<0.01）。正常組、模型組、參芪解郁方組灌胃2周后體質量明顯上升（P<0.01）;正常組、參芪解郁方組灌胃4周后體質量較灌胃2周明顯上升（P<0.01）。各時間點參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3.2? 各組大鼠產后游泳時間比較

灌胃1、2、4周后，與正常組相比，模型組大鼠的游泳時間顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組游泳時間顯著增加，差異有統計學意義（P<0.01）。正常組、模型組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃2周較灌胃1周游泳時間明顯增加（P<0.01）;正常組、模型組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃4周較灌胃2周游泳時間明顯增加（P<0.01）。各時點參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

3.3? 各組大鼠OFT總分比較

灌胃1、2、4周后，與正常組相比，模型組大鼠曠場試驗總分顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃2周較灌胃1周曠場試驗得分總分明顯增加（P<0.01）;正常組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃4周較灌胃2周曠場試驗得分總分明顯增加（P<0.01，P<0.05）。各時點參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3.4? 各組大鼠的蔗糖水消耗比較

灌胃1、2、4周后，與正常組相比，模型組大鼠各時間點蔗糖水消耗顯著降低（P<0.01），說明抑郁模型復制成功。與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組蔗糖水消耗明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）。參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃2周較灌胃1周蔗糖水消耗明顯增加（P<0.01）;正常組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃4周較灌胃2周曠場蔗糖水消耗明顯增加（P<0.01）。各時間點參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

3.5? 各組大鼠0T/TT比較

灌胃1、2、4周后，與正常組相比，模型組0T/TT顯著降低（P<0.01），說明模型復制成功;與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組0T/TT比值明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）。正常組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃2周較灌胃1周0T/TT明顯增加（P<0.01）;正常組、參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組灌胃4周較灌胃2周0T/TT明顯增加（P<0.01）。各時間點參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

3.6? 各組大鼠雙側前額葉皮質、海馬的腦代謝物濃度

與正常組相比，模型組大鼠雙側前額葉皮質的NAA/Cr、Cho/Cr值明顯下降，Glu/Cr明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05）。與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組NAA/Cr、Cho/Cr值顯著升高、Glu/Cr值顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05）;參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表6。

與正常組相比，PPD模型組大鼠雙側海馬的NAA/Cr、Cho/Cr值明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05）。與模型組相比，參芪解郁方組、鹽酸氟西汀組雙側海馬NAA/Cr、Cho/Cr值顯著升高（P<0.01）。參芪解郁方組與鹽酸氟西汀組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表7。

4 討論

在中醫理論中，產后抑郁可歸屬“郁病”“百合病”的范疇。中醫傳統理論認為氣血虧虛貫穿于產后病的始終，氣機失調是產后精神障礙類疾病發病的重要原因。肝處中焦，為一身氣機之樞紐，氣血的運行，情志的條暢，均取決于肝主疏泄功能的正常。產后氣血虧虛，運行無力，氣機不暢，心神失養，因虛致實，產生氣滯痰瘀等時邪，又兼有情志不舒，使濁毒瘀滯腦絡而誘發郁病。而氣郁日久又會導致氣血耗傷，因實致虛，從而遷延難愈。本病多本虛標實，與心、肝、脾等臟腑功能失調密切相關，治當補血養心、解郁醒神，故立參芪解郁方。

4.1? 參芪解郁方對PPD大鼠行為學的調節作用

本實驗采用母嬰分離應激誘導母鼠出現抑郁癥的典型癥狀來制備產后抑郁動物模型，母嬰分離動物模型是將母鼠和仔鼠進行為期21 d的分離應激是一種較為成熟的公認的產后抑郁大鼠模型[16-17]，已經得到廣泛應用。課題組前期[18-20]在母嬰分離應激后，成功制備了產后抑郁的動物模型，經測試，產后抑郁模型的大鼠蔗糖水消耗降低，曠場試驗中水平和垂直活動次數減少，這與產后抑郁患者的臨床癥狀相近。因此，本研究繼續采用此種造模方法。本研究結果發現PPD模型組大鼠的不動時間較正常組增加，游泳時間、OFT總分、蔗糖水消耗、進入OE/TE比例較正常組減少，而中藥參芪解郁方能夠有效改善上述指標，提示中藥對焦慮、抑郁情緒具有明顯的治療作用，且隨著治療時間的延長，治療效果逐漸顯著。

4.2? 參芪解郁方對PPD大鼠腦內代謝物濃度的影響

MRS是基于磁共振成像，利用化學位移作用，測定人體內能量代謝及進行化合物定量分析的一種技術，是目前唯一顯示活體組織代謝的無創影像學方法[21-22]。它不僅能夠對能量代謝水平進行量化，而且還可以為我們提供神經元完整性和神經遞質可用性的參數，因此，它也可以用來評價大鼠空間學習和記憶能力。本研究采用MRS檢測PPD大鼠前額葉皮質及海馬區域代謝物的濃度，并從腦代謝的角度觀察參芪解郁方對PPD發生發展的干預作用。

NAA是1H-MRS譜中觀察到的主峰，是神經元、軸突結構完整性的標志[23]，NAA的減少可以反映神經元細胞死亡或功能障礙[24]。本研究觀察到PPD模型組大鼠雙側前額葉皮質、海馬區域的NAA的濃度顯著下降，可能提示PPD大鼠存在神經元密度降低、完整性喪失以及空間學習和記憶能力下降，這與目前的大多數研究結果大致相似[25-27]。其機制可能與糖皮質激素水平升高有關，已有研究表明，慢性生理或心理壓力會刺激糖皮質激素的分泌[28]。大量觀察表明[29-31]，糖皮質激素治療可抑制齒狀回的神經發生，減少海馬、前額葉皮質神經元樹突萎縮、突觸丟失，最終恢復神經元功能，在MRS上可表現為NAA增加Cho是與情緒、認知密切相關的神經遞質乙酰膽堿的前體[32]，是情感障礙發生的病理生理基礎，也是神經細胞膜磷脂代謝的一部分。本研究發現PPD模型組大鼠雙側前額葉皮質、海馬的Cho/Cr值降低，與既往多項研究結果一致[33-34]，分析其可能原因為產后抑郁作為一種慢性應激造成腦內細胞膜磷脂代謝異常，影響細胞內信號轉導，從而阻礙情緒調節環路神經元功能的實現，導致抑郁癥狀，但也可能是多種代謝物異常的綜合作用所致，需要進一步研究來進行證實。

Glu被認為是抑郁癥的潛在生物標志物[35]，關于PPD腦內代謝物Glu/Cr的變化，目前尚無統一結論，本研究結果顯示，雙側海馬的Glu/Cr顯著升高，雙側前額葉皮質的Glu/Cr降低，這可能與所測腦區的不同有關，有相關研究[36]指出大鼠體內海馬區域代謝物濃度的變化可能與其他區域不同，海馬和前額葉皮質內Glu/Cr變化提示PPD大鼠體內興奮性氨基酸與抑制性氨基酸遞質相對濃度失去平衡，佐證了谷氨酸能系統障礙在產后抑郁的病理生理中所發揮的重要作用。

mI被認為神經膠質細胞的標志物，它的升高通常被解釋為反映了細胞內信號轉導系統的紊亂和膠質細胞功能障礙[37]，mI的代謝水平的常與重度抑郁密切相關[30]。本研究發現在PPD大鼠雙側海馬和前額葉皮質的mI無明顯變化，這可能與該組大鼠正處于產后抑郁的早期有關，但本研究認為其對于PPD早期預示并無明確相關性。

參芪解郁方由黨參、黃芪、炒棗仁、當歸、郁金、山茱萸肉、陳皮、佛手組成，具有補血養心、解郁醒神之效，課題組前期動物實驗和臨床研究從腦內單胺類神經遞質水平及其代謝產物變化、T細胞免疫調節等方面論述了參芪解郁方的確切療效。本研究主要從腦代謝的角度分析參芪解郁方的作用機制，結果顯示，與模型組相比，中藥參芪解郁方組能夠升高NAA/Cr、Cho/Cr，降低Glu/Cr值，提示參芪解郁方可修復受損的神經元，促進神經的重塑，調節膜磷脂的代謝、興奮性神經遞質和抑制性神經遞質濃度，這可能是其發揮抗抑郁作用、改善產后抑郁癥狀的主要機制。

綜上所述，本研究結果表明產后抑郁腦內代謝物濃度的改變，海馬及前額葉皮質神經元的損傷，膽堿物質的代謝異常，以及谷氨酸能系統異常等病理過程。本研究通過采用MRS技術觀察參芪解郁方對PPD大鼠的干預作用，參芪解郁方作用特點為多靶點、多途徑、整體調節，能夠明顯改善產后抑郁癥狀，且其對于情緒調節環路神經元的功能修復和保護的作用尤為突出，值得推廣應用于臨床。

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