磷酸二酯酶4抑制劑咯利普蘭對慢性應激抑郁模型大鼠學習記憶及海馬突觸可塑性的影響

劉丹　藺曉源　文詩儀　劉彤彤　孟盼

〔摘要〕 目的 探討磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4， PDE4）抑制劑咯利普蘭對慢性應激抑郁模型大鼠行為活動、學習記憶及海馬突觸可塑性的影響。方法 采用慢性溫和不可預見性應激的方式建立抑郁模型，將SD大鼠隨機分為4組，即空白組、抑郁模型組、氟西汀組、咯利普蘭組。造模的同時，氟西汀組灌胃氟西汀（5.4 mg/kg），咯利普蘭在實驗的第1、7、14、21天腹腔注射給藥，均按1.25 mg/kg給藥，模型組腹腔注射等量生理鹽水，觀察咯利普蘭對抑郁模型大鼠曠場、水迷宮的影響，ELISA檢測血漿和海馬組織中cAMP水平的變化，免疫組化觀察各組大鼠海馬突觸素（synaptophysin， SYN）的表達，Western blot檢測PI3K、p-CREB、BDNF的表達情況。結果 與空白組比較，模型組大鼠活動量下降（P<0.01），目標象限的穿越次數下降（P<0.05）、潛伏時間增加（P<0.01），血漿、海馬組織中cAMP含量下降（P<0.01），海馬SYN、BDNF、PI3K、p-CREB的表達下調（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，咯利普蘭能顯著增加抑郁模型大鼠的活動量（P<0.01），增加穿越目標象限的次數（P<0.05），降低目標象限的潛伏時間（P<0.05），增加血漿、海馬組織中cAMP的含量（P<0.05或P<0.01），并能顯著促進模型大鼠海馬SYN、BDNF、PI3K、p-CREB的表達（P<0.05或P<0.01）。結論 咯利普蘭能顯著改善抑郁模型大鼠的學習記憶能力并能促進海馬突觸可塑性，其機制可能與調節海馬BDNF-PI3K信號通絡的相互作用緊密相關。

〔關鍵詞〕 抑郁癥;咯利普蘭;磷酸二酯酶4;海馬;突觸可塑性;學習記憶

〔中圖分類號〕R969;R2? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.007

〔Abstract〕 Objective To investigate the molecular mechanism of phosphodiesterase 4 （PDE4） inhibitor rolipram on behavioral activity， memory and hippocampal synaptic plasticity in chronic unpredicted mild stress （CUMS） rats. Methods The depressed rats were established by CUMS. SD rats were randomly divided into 4 groups： blank control group， depression model group， fluoxetine group and rolipram group. At the same time of modeling， fluoxetine group was given fluoxetine （5.4 mg/kg） by gavage， and roliplam group was given intraperitoneally at 1.25 mg/kg on day 1， 7， 14 and 21 of the experiment. Model group was injected intraperitoneally with the same amount of normal saline. The effects of rolipram on open field test and water maze test of depression model rats were observed. The changes of cAMP level in plasma and hippocampus were detected by ELISA. Synaptophysin （SYN） in hippocampus of rats was observed by immunohistochemistry， and PI3K， p-CREB， BDNF were detected by Western blot. Results Compared with normal group， the activity of rats in model group decreased （P<0.01）， the number of crossing target quadrant decreased （P<0.05）， the latency time increased （P<0.01）， the content of cAMP in plasma and hippocampus decreased （P<0.01）， and the expressions of SYN， BDNF， PI3K and p-CREB in hippocampus were down-regulated （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， rolipram could significantly increase the scores of activities of the depressed model rats （P<0.01）， significantly promote the times of crossing the target quadrant （P<0.05）， reduce the latency time of the target quadrant （P<0.05） and increase the content of cAMP in plasma， hippocampal tissue （P<0.05 or P<0.01）， and can significantly promote the model of rat hippocampal SYN， BDNF， PI3K， and P-CREB （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Rolipram can significantly improve the learning and memory ability of CUMS rats and promote synaptic plasticity of hippocampus， which may be closely related to the interaction between BDNF-PI3K signal pathway of hippocampal.

〔Keywords〕 depression; rolipram; phosphodiesterase 4; hippocampus; synaptic plasticity; learning and memory

磷酸二酯酶（phosphodiesterase， PDE）是第二信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP ）的特異性水解酶，對細胞內環核苷酸信號具有重要的調控作用。咯利普蘭是磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4， PDE4）高效選擇性抑制劑，動物實驗及臨床試驗證明其具有改善認知及調控神經元凋亡等多種功能[1]。cAMP/環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB）是目前抑郁癥中闡述最為清晰的一條通路，即G蛋白偶聯受體作用于下游的PDE，通過下調第二信使cAMP的水平，降低cAMP依賴的蛋白激酶A的活性進而減少CREB的Ser133 位磷酸化，最終抑制海馬可塑性相關基因的誘導和調控[2]。PDE4能夠特異性地將cAMP降解為AMP，而PDE4特異性抑制劑咯利普蘭能夠逆轉上述反應，以達到抗抑郁的功效[3]，然其機制尚不清晰。本研究旨在觀察咯利普蘭對抑郁模型大鼠行為學及學習記憶的影響，并初步分析其調節海馬神經可塑性的分子機制。

1 材料

1.1? 實驗動物

健康雄性SD大鼠，SPF級，220～240 g，由湖南斯萊科景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2009-0004，動物合格證號：HNASLKJ20170829。在光/暗周期為12 h/12 h的條件下飼養于籠中，自由獲得飼料和飲水。

1.2? 藥物

咯利普蘭（貨號：R6520，規格：25 mg，美國Sigma-aldrich公司）;鹽酸氟西汀膠囊（20 mg/粒，法國禮來蘇州制藥有限公司生產，批號：0722A）購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。

1.3? 主要試劑

多聚賴氨酸（北京中杉金橋生物技術有限公司， ZLI9005）;cAMP ELISA檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）;GAPDH（BA2913）、SYN一抗（BA1421）、BDNF一抗（BA5260）、PI3K一抗（BA5260）、p-CREB一抗（BA5260）均購自英國Abcam公司;PVDF膜（密理博中國有限公司）。

1.4? 主要儀器

近紅外雙色激光成像系統（美國LI-COR公司）;凝膠成像儀（美國Bio-rad公司）;生物組織切片機（德國徠卡公司）。

2 方法

2.1? 分組與造模

大鼠適應環境3 d后根據自主活動的數量隨機分為4組，每組10只，即空白組、慢性應激抑郁模型組、氟西汀組、咯利普蘭組。空白組每籠5只飼養，不給予任何刺激，其余各組每天隨機給予不同刺激用以復制慢性應激抑郁模型，包括傾籠45 ℃、夾尾（1 min）、禁食（24 h）、晝夜顛倒（24 h）、4 ℃冰浴（15 min）、潮濕墊料（24 h）、噪音（4 h），每天隨機安排1種，3 d內的刺激方法不重復[4]。

2.2? 給藥

除空白組外，咯利普蘭組造模同時腹腔注射給藥，給藥時間為實驗第1、7、14、21天，給藥劑量為1.25 mg/kg，同時灌胃一定體積的蒸餾水;氟西汀組灌胃給藥，給藥劑量為5.4 mg/kg，同時腹腔注射一定體積的生理鹽水。模型組在造模的同時灌胃等體積的蒸餾水和注射一定體積的生理鹽水。

2.3? 行為學測定

2.3.1? 曠場試驗? 黑色正方形敞箱（40 cm×80 cm×80 cm），將底面平均劃分為面積相等的方格，將大鼠面向箱壁從統一固定點放入敞箱中，以穿越底面方格數為水平得分，以直立次數為垂直活動得分，記錄大鼠在4 min內的活動次數（水平得分+垂直得分）。

2.3.2? 水迷宮測試? 將大鼠面向池壁放入水中，60 s內未爬上平臺的則將其牽引至平臺處，并停留20 s，連續訓練4 d，每天1次。正式試驗時，將大鼠從第二象限處面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺（第四象限）的逃避潛伏期（escape latency， EL）。撤除平臺后，由同一水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄4 min內穿越目標象限的次數。

2.3.3? 腦標本的采集? 大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉（100 mg/kg），呈深度麻醉后，仰位暴露心臟，經心尖部插入灌注生理鹽水250 mL左右，再灌注4 ℃4%多聚甲醛200 mL，后剝離腦組織標本，進行固定、脫水、包埋、切片，留待備用。

2.3.4? ELISA檢測? 嚴格按照cAMP的ELISA試劑盒說明書檢測血漿、海馬組織勻漿液中的cAMP含量。

2.3.5? 免疫組化檢測? 切片常規脫蠟，3% H2O2滅活內源性酶，熱抗原修復，冷卻后洗滌，5% BSA封閉，室溫20 min，加入兔抗大鼠SYN抗體（1∶500稀釋），4 ℃過夜，滴加羊抗兔二抗于37 ℃孵育20 min，洗滌，DAB顯色，蘇木素復染，封片。

2.3.6? Western blot檢測? 取海馬組織，按每1 mg組織加入5 μL RIPA裂解液的比例，冰上勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液制備組織蛋白提取液，BCA法測定其蛋白含量，保存待用。制備分離膠與濃縮膠，SDS-PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，后加入PI3K（1∶500）、p-CREB（1∶800）、BDNF（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗于4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶2 000）并于室溫下孵育2 h，化學發光法顯影，應用ImageJ圖像處理軟件對條帶進行掃描，計算各組目的蛋白的相對表達量。

2.3.7? 數據收集? 利用MoticB 5圖像分析軟件進行圖像采集和處理。對照大鼠腦立體定位圖譜，各組每只大鼠選取大致相同部位的3張切片，每張切片分別在海馬的CA3區選取5個互不重疊的視野，在400倍光鏡下分別測量各個視野SYN陽性細胞的光密度值，取其平均值作為此切片的平均灰度值。

2.4? 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，實驗數據以“x±s”表示。滿足正態性和方差齊性時使用單因素方差分析比較各組間差異，否則使用H檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 咯利普蘭對慢性應激抑郁模型大鼠行為學指標的影響

3.1.1? 對開野實驗的影響? 與空白組比較，模型組大鼠4 min內活動量顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，咯利普蘭和氟西汀可顯著提升模型大鼠的活動量（P<0.05或P<0.01）。見圖1。

3.1.2? 對慢性應激抑郁模型大鼠學習記憶的影響? 與空白組比較，模型大鼠爬上平臺的EL增加，穿越目標象限的次數減少，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，氟西汀、咯利普蘭能顯著降低模型大鼠爬上平臺的潛伏期，升高模型大鼠穿越目標象限的次數，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

3.2? 血漿、海馬組織中cAMP水平的變化

與空白對照組比較，模型組大鼠血漿和海馬組織中cAMP的水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，鹽酸氟西汀、咯利普蘭均能不同程度地上調模型大鼠血漿和海馬組織中cAMP的含量，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。見圖3。

3.3? 免疫組化檢測模型大鼠海馬CA3區SYN的表達

與空白組比較，模型組大鼠海馬CA3區SYN的積分光密度值顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，氟西汀、咯利普蘭能顯著增加模型大鼠海馬SYN的積分光密度值，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4、圖5。

3.4? Western blot檢測模型大鼠海馬PI3K、BDNF、p-CREB表達的情況

與空白組比較，模型組大鼠海馬PI3K、BDNF、p-CREB的平均密度值顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，氟西汀、咯利普蘭能顯著增加模型大鼠海馬PI3K、BDNF、p-CREB的表達，差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05）。見表1、圖6。

4 討論

慢性溫和不可預見性應激是抑郁癥的一個主要促發因素，故而本實驗采用經典的慢性輕度不可預見性應激的方式建立抑郁模型。建模21 d后，模型組大鼠自主活動量下降，Morris水迷宮中定位航行潛伏期延長，空間搜索時在目標象限的穿越次數減少，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），提示模型復制成功。

cAMP-CREB-BDNF是抗抑郁藥物起效的重要途徑和作用靶點[5]，同時，該通路亦是調節抑郁癥海馬神經可塑性的關鍵信號通路之一[6]。cAMP作為一種重要的轉錄因子，其含量增加可促進大鼠學習記憶活動的加強。PDE4能夠特異性催化cAMP的水解并減少細胞內cAMP的濃度，進而通過抑制CREB/BDNF通路降低對學習記憶及海馬神經可塑性的促進效應[7]。研究表明，PDE4基因的缺失可使小鼠在懸尾實驗和強迫游泳實驗中的不動時間縮短，顯示出明顯抗抑郁功效[8]。在本實驗的行為學方面，PDE4抑制劑咯利普蘭能顯著增加抑郁模型大鼠的活動量，并能明顯升高模型大鼠穿越目標象限的次數，縮短目標象限的潛伏期，提示咯利普蘭能顯著改善抑郁模型動物的抑郁樣行為并能有效促進模型的學習記憶能力。

CREB第133位的絲氨酸殘基被磷酸化后可與cAMP反應元件CRE結合，調節下游靶基因的轉錄。研究表明，重復經顱磁刺激能通過缺血側海馬區細胞核內CREB的磷酸化促進SYN的表達[9]。SYN是位于突觸前膜的特異性標志蛋白，因其參與神經元的突觸形成而被認為是突觸可塑性的標志物[10]。本研究發現，PDE4抑制劑咯利普蘭能顯著增加血漿和海馬組織中cAMP的含量，并能增加海馬磷酸化CREB和SYN的表達，提示咯利普蘭可能通過cAMP-CREB信號增強抑郁模型海馬神經元可塑性而達到抗抑郁的功效。

BDNF作為細胞內多條信號通路的關鍵節點對學習記憶的維持及海馬突觸可塑性具有重要調節作用[11]。BDNF可通過與PI3K信號相互影響調節海馬的突觸可塑性，即PI3K能使CREB磷酸化進而介導BDNF基因的表達，同時，BDNF激活后作用于其受體可進一步觸發PI3K信號[12]。研究表明，PI3K通過調控突觸可塑性與抑郁癥的發生緊密相關[13]。乙酰左旋肉堿可通過PI3K信號介導的BDNF增加達到快速抗抑郁的功效，而其抗抑郁功效可被PI3K抑制劑阻斷[14]。本實驗發現，咯利普蘭能顯著提升海馬組織中PI3K、BDNF的表達，同時p-CREB的表達亦增加，提示咯利普蘭可能通過調節BDNF與PI3K信號的相互作用而促進慢性應激抑郁模型大鼠的海馬突觸可塑性。

綜上，咯利普蘭能有效改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為并能增加模型大鼠的學習記憶能力，其機制可能是通過增加血漿和海馬組織中cAMP的含量，啟動cAMP-CREB信號并進一步調節BDNF-PI3K信號的相互作用而促進慢性應激抑郁模型大鼠的海馬突觸可塑性。

參考文獻

[1] NATURA M， CATHERINE L C， SHEINA E， et al. Tau-driven 26S proteasome impairment and cognitive dysfunction can be prevented early in disease by activating cAMP-PKA signaling[J]. Nature Medicine， 2016， 22（1）： 46-53.

[2] WANG X L， GAO J， WANG X Y， et al. Treatment with Shuyu capsule increases 5-HT1AR level and activation of cAMP-PKA-CREB pathway in hippocampal neurons treated with serum from a rat model of depression[J]. Molecular Medicine Reports， 2018， 17（3）： 3575-3582.

[3] FUJITA M， RICHARDS E M， NICIU M J， et al. cAMP signaling in brain is decreased in unmedicated depressed patients and increased by treatment with a selective serotonin reuptake inhibitor[J]. Molecula Psychiatry， 2017， 22（5）： 754-759.

[4] 孟? 盼，柳? 卓，朱? 青，等.百事樂膠囊對抑郁模型大鼠海馬隔顳軸BDNF、NT-3、NGF表達的影響[J].中國臨床藥理學與治療學， 2017，（4）：418-423.

[5] WANG H Y， ZHANG Y Q， QIAO M Q. Mechanisms of extracellular signal-regulated kinase/cAMP response element-binding protein/brain-derived neurotrophic factor signal transduction pathway in depressive disorder[J]. Neural Regeneration Research， 2013， 8（9）： 843-852.

[6] ZHANG M Q， LI R， WANG Y Q， et al. Neural plasticity is involved in physiological sleep， depressive sleep disturbances， and antidepressant treatments[J]. Neural Plasticity， 2017， 2017： 5870735.

[7] TARAI S， MUKHERJEE R， GUPTA S， et al. Influence of pharmacological and epigenetic factors to suppress neurotrophic factors and enhance neural plasticity in stress and mood disorders[J]. Cognitive Neurodynamics， 2019， 13（3）： 219-237.

[8] KANG H J， PARK Y， YOO K H， et al. Sex differences in the genetic architecture of depression[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 9927.

[9] MENG J， CHEN Y， BI F， et al. Pterostilbene attenuates amyloid-β induced neurotoxicity with regulating PDE4A-CREB-BDNF pathway[J]. American Journal of Translational Research， 2019， 11（10）： 6356-6369.

[10] ZAK N， MOBERGET T， B？en E， et al. Longitudinal and cross-sectional investigations of long-term potentiation-like cortical plasticity in bipolar disorder type II and healthy individuals[J]. Translational Psychiatry， 2018， 8（1）： 103.

[11] SEN T， GUPTA R， KAISER H， et al. Activation of PERK elicits memory impairment through inactivation of CREB and downregulation of PSD95 after traumatic brain injury[J]. Journal of Neuroscience， 2017， 37（24）： 5900-5911.

[12] ZHANG G X， ZHANG T， LI N， et al. Tetramethylpyrazine nitrone activates the BDNF/Akt/CREB pathway to promote post-ischaemic neuroregeneration and recovery of neurological functions in rats[J]. British Journal of Pharmacology， 2018， 175（3）： 517-531.

[13] YAN T X， HE B S， WAN S T， et al. Antidepressant-like effects and cognitive enhancement of Schisandra chinensis in chronic unpredictable mild stress mice and its related mechanism[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 6903.

[14] WANG W， LU Y， XUE Z， et al. Rapid-acting antidepressant-like effects of acetyl-l-carnitine mediated by PI3K / AKT / BDNF / VGF signaling pathway in mice[J]. Neuroscience， 2015， 79（5）： 285-289.