五株酵母菌的分離鑒定及產丁二酸能力分析

張 霞，雷學俊，楊康卓，羅青春，廖勤儉，劉多濤，喬宗偉，2，鄭 佳，2

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644007）

酵母菌是白酒釀造微生物區系中非常重要的組成部分，它可以分解釀造原料產生酯類、醇類、酮類、酸類、酚類、烯類、吡嗪類等風味物質[1]，對產酒率和酒質至關重要。

酵母菌發酵代謝可產生一種叫丁二酸的物質，又叫琥珀酸，是一種二元羧酸，能發生二元酸的大多數典型反應，如鹵化、酯化、碘化等，也是合成各種復雜有機物的中間體。丁二酸作為三羧酸循環過程中的一種四碳化合物被廣泛應用于醫藥、食品、化工、農業等行業[2-3]，可用于合成氨基酸、鎮靜劑、維生素、1,4-丁二醇、N-甲基吡咯烷酮以及酸化劑、風味調節劑等[4-6]，琥珀酸（包括鹽類）可產生酸味和呈味物質，可用于豆醬、醬油、日本酒、調味料[6]等。丁二酸進行酯化形成的丁二酸酯類是一種生物活性成分，可以提高白酒的健康價值，而且丁二酸酯類具有愉快的氣味，對酒類的香味呈現有著一定的貢獻[7-10]。丁二酸還可以作為中間體合成γ-丁內酯、1,4-丁二胺、四氫呋喃等化合物[11]，這些化合物對白酒的風味形成有重要作用。

盧春芳等[12]在6株酵母菌中篩選出高活性酵母菌，其中熱帶假絲酵母產丁二酸的能力最強，培養液中丁二酸含量為119.70 μg/mL；高翠娟等[13]通過基因敲除的方法獲得可積累琥珀酸的解脂酵母重組菌，以提高琥珀酸的產量；申乃坤等[14]以牛胃內容物為菌源,利用富馬酸鈉為唯一碳源并加入高濃度丁二酸鈉的選擇培養基篩選到1 株丁二酸產量較高，副產物較少的菌株，經鑒定為產琥珀酸放線桿菌。

本研究從不同培養基之間產丁二酸能力高低出發，通過5 株不同屬的酵母菌在不同培養基之間發酵產丁二酸的對比，發現這5 株不同屬的酵母菌在五糧粉液中產丁二酸能力最強，而五糧粉則是五糧液釀造的糧食原材料，這對研究五糧液白酒風味多樣性的形成有一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

所有酵母菌株均由本實驗室保藏，分離自五糧液釀造環境中。

1.1.2 培養基

分離篩選培養基：麥芽汁瓊脂培養基、YEPD瓊脂培養基均為商業用合成培養基。

發酵培養基：麥芽汁培養基、YPD 液體培養基均為商業用合成培養基。

五糧粉[15]糖化液：五糧粉糖化液由高粱、小麥、大米、糯米和玉米5 種糧食按一定比例打碎混合組成，五糧粉∶水以1∶10 比例煮沸糊化，冷卻后加入糖化酶、液化酶，最后過濾調糖度終濃度至12～13°Bx。

以上培養基均121 ℃下0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 主要試劑和儀器

麥芽汁瓊脂培養基、YEPD 瓊脂培養基、麥芽汁培養基、YPD 液體培養基，青島海博生物技術有限公司；葡萄糖(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；API20ACUX 鑒定試劑盒，生物梅里埃公司；FKC-1型浮游菌采樣器，浙江蘇凈凈化設備有限公司；離心機，Eppendorf 公司；顯微鏡，Olympus 公司；生化培養箱，上海一恒科技儀器有限公司；美國Agilent 公司1290 系列高效液相色譜儀(HPLC)-6520B 系列質譜檢測器（QTOF），Agilent MassHunter 數據采集工作軟件、定性定量分析軟件，Milli-Q 超純水機（美國Millipore公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離

在五糧液釀酒車間和制曲車間外圍環境采集樣品，采用FKC-1 型浮游菌采樣器，距離地面80 cm，將直徑為9 cm 的麥芽汁瓊脂平板置于采樣器內，每次采樣設置3 個平行，空氣流量為100 L/min，采樣時間為1 min。然后將平板倒置于28 ℃培養箱中培養2～3 d，待菌落長出后，挑選菌落形態不同的疑似酵母單菌落于麥芽汁瓊脂培養基中，編號并劃線純化，重復純化2～3 次，直至平板上的菌落都為同一形態，利用傳代培養法，在4 ℃下進行斜面保存并編號。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 菌株形態學鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進行[16]。

菌落形態觀察：將純化后的菌株接種于YEPD平板，置28 ℃下培養2～3 d，單菌落觀察，并記錄菌落的大小、顏色、形狀、質地、透明度、邊緣、濕潤程度等菌落特征。

顯微鏡觀察細胞形態：挑取單菌落于5 mL YPD 液體培養基中28 ℃、120 r/min 振蕩培養24 h，顯微鏡下觀察細胞的形態特征。

1.3.2.2 菌株生理生化鑒定

按照API 20A CUX 鑒定試劑盒所述方法測定菌株的生理生化特征。假菌絲觀察：將酵母接種于玉米粉瓊脂培養基上，28 ℃培養3 d，觀察酵母是否含有假菌絲。

1.3.2.3 菌株分子鑒定

基因組DNA的提取：將活化的菌株接入40 mL麥芽汁培養基中，160 r/min、28 ℃培養24 h 后，室溫、12000 r/min 離心5 min 獲得菌體，用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株的基因組DNA，置于-20 ℃下備用。

PCR 擴增：采用酵母菌通用引物為NL1（5-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'），PCR 反 應體系包括0.5 μL 的基因組DNA、2.5 μL 的10×Buffer（含Mg2+）、1 μL的dNTP、0.2 μL的聚合酶、0.5 μL的引物、0.5 μL 模板，加雙蒸水至25 mL；PCR 循環條件為94 ℃4 min 預變性、94 ℃45 s 變性、55 ℃45 s退火、72 ℃1 min延伸、循環30次，72 ℃10 min修復延伸，4 ℃終止反應。經PCR 反應擴增出26S rDNA 產物，用PCR 及酶反應產物純化試劑盒將PCR 產物進行純化，將純化產物交由上海生工生物工程股份有限公司完成測序工作。

1.3.3 酵母菌的系統發育分析

參考文獻[17]，將測得的26S rDNA D1/D2 序列在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對，選取相似度較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2 區域序列作為參比對象；利用MEGA5.0 軟件進行多序列比對、Kimura-2 模型計算進化距離、最后采用鄰位相連(Neighbor-Joining)繪制系統發育樹，其中進化樹拓撲分析為1000次重復取樣的結果。

1.3.4 丁二酸的測定

取終濃度酵母菌活菌數105～106個/mL菌液接種于3 種發酵培養基中，以未接菌的培養基作為對照。28 ℃靜置培養48 h 后，將發酵液12000 r/min離心5 min，取上清液0.22 μm 濾膜過濾，用HPLC法測定發酵液中丁二酸的含量。色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1*100 mm 1.8-micron)；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL；流動相為甲醇B（液質級）和超純水A（含0.05 g/L甲酸）；梯度洗脫條件：0～8 min：2 %～98 %B，8.1～12 min：98 %B，12.1～14 min：2 %B，15 min：stop。質譜條件：采用電噴霧電離源(DESI)；負離子模式掃描；離子源溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化器壓力為40 psig；碰撞電壓為90 V。標曲：Y=202.7x+10770。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 形態特征

5株不同屬酵母菌菌落和顯微鏡形態結構如圖1，具體形態結構描述見表1。

表1 酵母菌的菌落和微觀形態描述

圖1 酵母菌的菌落和微觀結構

2.1.2 生理生化特征

生理生化特征鑒定結果如表2 所示，此5 株菌均能發酵利用葡萄糖作為碳源，均不能發酵利用2-酮基-葡萄糖酸鹽、L-阿拉伯糖、側金盞花醇、木糖醇和N-乙酰氨基葡萄糖。Y3可利用D-木糖，其他4 株菌則不可以；Y1、Y2、Y3、Y5 可發酵利用的碳源種類較多，而Y4 僅可利用D-半乳糖和纖維二糖兩種碳源。形態學試驗結果顯示，除了Y5 有假菌絲外，其他4株菌均沒有假菌絲出現。

表2 酵母菌生理生化檢測結果

2.1.3 菌株的分子鑒定結果

從表3 可以看出，Y1 與Kazachstania bulderi的相似度為100 %、Y2 與Saccharomyces cerevisiae的相似度為100 %、Y3 與Zygosaccharomyces bailii的相似度為100 %、Y4 與Naumovozyma castellii的相似度為99.52 %、Y5 與Saccharomycopsis fibuligera的相似度為100%，說明菌株Y1、Y2、Y3、Y4 和Y5都已經在NCBI中找到相似度非常高的菌株。

表3 酵母菌26S rDNA的同源性分析結果

2.2 系統發育分析

此5 株不同屬的酵母菌株的26S rDNA D1/D2序列和用BLAST 檢索到的與之有高度同源性菌株的26S rDNA D1/D2 序列通過MEGA5.0 軟件進行比對和構建N-J 系統發育樹，結果見圖2。可通過系統發育樹的建立對此5 株不同屬的酵母菌種間親緣關系進行直觀界定。

由圖2 可以直觀地看出，Y1 和Kazachstania bulderi聚為一支、Y2 和Saccharomyces cerevisiae聚為一支、Y3 和Zygosaccharomyces bailii聚為一支、Y4 和Naumovozyma castellii聚為一支、Y5 和Saccharomycopsis fibuligera聚為一支。結合相似度（表3）和系統發育樹（圖2），該5 株酵母菌可以清晰地鑒定到種。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區域序列和neighbor-joining分析法繪制菌株系統發育樹

2.3 不同培養基條件下丁二酸產量的測定

用HPLC 法測定發酵液中丁二酸的含量，結果如圖3 所示。同一菌株在3 種培養基中丁二酸的產量有顯著性差異（p＜0.05），該5 株菌都是在五糧粉液培養基中產丁二酸能力最強，其次是麥芽汁液體培養基，YPD液體培養基中丁二酸產量最低。菌株Y4 在五糧粉液培養基中丁二酸產量最高，可高達478.8 mg/L。五糧粉液中葡萄糖含量較高，通過葡萄糖代謝提高了丁二酸的糖酸轉化率[18]，但對于此5株菌在五糧粉液培養基中產丁二酸能力最強的原因目前尚未完全弄清楚，還有待于進一步研究。菌株Y4 為Naumovozyma castellii，為產乙醇酵母，其在五糧粉液培養基中產乙醇能力較強，應該是通過乙醇合成丁二酸途徑產丁二酸。

圖3 5株菌在不同培養基中丁二酸的產量

3 結論

從五糧液釀造環境中分離到5 株不同屬的酵母菌株，此5 株酵母菌用26S rDNA 序列可以鑒定到種，分屬于Kazachstania bulderi、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Naumovozyma castellii、和Saccharomycopsis fibuligera5 個不同的屬；5 株不同屬酵母菌在3 種不同培養基中產丁二酸的能力有明顯不同，在五糧粉液培養基中產丁二酸能力均為最強，其次是麥芽汁液體培養基，YPD液體培養基中丁二酸產量最低。其中，菌株Y4（Naumovozyma castellii）在五糧粉液培養基中丁二酸產量最高。