煙草根結線蟲病生防菌株TB-68的鑒定及室內防效測定

付 博，張 潔，張蒙蒙，都亞飛，王 靜*，彭建斐*

1.河南農業大學煙草學院，鄭州市文化路95號 450002 2.河南省農業科學院植物保護研究所，鄭州市花園路116號 450002 3.湖南省煙草公司懷化市公司，湖南省懷化市鶴城區湖天南路446號 418000

煙草根結線蟲病是世界各國煙草生產中最重要的線蟲病害之一［1-3]。由于我國大部分煙田長期連作，土壤中的線蟲基數逐年增多，根結線蟲病目前已成為我國煙草產區的主要病害［4-6]。根結線蟲主要侵染煙草根系并形成根結或結癭，破壞根組織的分化和生理活動，導致植株出現葉尖、葉緣干枯內卷癥狀。根結線蟲侵染煙草根部造成的傷口還會促進其他真菌和細菌性病害的侵染，嚴重影響煙葉的產質量。然而生產上為防控煙草根結線蟲病使用的化學殺蟲劑危害人畜健康并污染生態環境［7]，隨著人們對煙葉安全性的日益關注，煙草根結線蟲病的生物防治也越發重要［8-9]。生物防治具有持效期長、對生態安全、對人畜友好等優點，在農業可持續發展模式中發揮著重要的作用［10]。翟 明 娟 等［11]研 究 發 現 綠 色 木 酶（Trichoderma viride）發酵液對根結線蟲二齡幼蟲的校正致死率高達98%，田間防效達到64.9%；黃金玲等［12]通過盆栽研究發現巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）對番茄根結線蟲病的防效達60%；唐佳頻等［13]報道南極土壤來源的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）生防效果可以達到71.67%，顯示出生物防治在根結線蟲綠色防控中的巨大應用前景［14]。目前，淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）、堅強芽胞桿菌（Bacillus firmus）、穿刺巴氏 桿 菌（Pasteuria penetrans）、蠟 質 芽 胞 桿 菌（Bacillus cereus）等［15-17]生防微生物已在多個國家被開發成商品制劑并用于根結線蟲的生物防治。此外，貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）也被應用于多種作物根結線蟲病的生物防治中，Burkett-Cadena等［18]報道貝萊斯芽胞桿菌FZB42菌株能夠減少番茄根部線蟲卵和幼蟲數量，且能有效減輕番茄灰霉病的發生；Xiang等［19]報道貝萊斯芽胞桿菌Bve2菌株能夠降低棉花根系中根結線蟲卵囊的數量，并能顯著增加棉花的產量。但目前關于煙草根結線蟲病生物防治的相關研究還較少，亟需探索對煙草根結線蟲具有生物活性的新生防資源。為此，本研究中對前期篩選出的生防細菌進行種類鑒定，并對其防治效果及生防機理進行初步研究，旨在為新型生物殺線蟲劑的開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 煙草品種、供試菌株及煙草根結線蟲根結

供試煙草品種為云煙87。TB-68菌株由煙草根結線蟲卵囊上分離獲得。在河南省洛陽市宜陽縣嚴重發生根結線蟲病的煙田中采集煙株發病根結［前期鑒定為南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）]，用于室內離體活性測定和盆栽防效測定。

1.1.2 培養基

營養瓊脂培養基（NA）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂17 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2；營養肉湯培養基（NB）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3 試劑

總糖含量測定試劑盒以及考馬斯亮藍法蛋白含量測試盒均購于蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株鑒定

將TB-68菌株在NA培養基上劃線，32℃培養15 h，觀察菌落特征并進行掃描電鏡觀察和革蘭氏染色，觀察其菌體大小、形狀、有無芽胞。利用CTAB法提取TB-68菌株的基因組DNA，采用通用引物27-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增其16S rDNA基因序列。PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果用BLAST軟件與GenBank中的已知序列進行比對。采用Mega 5.0軟件對TB-68菌株進行系統發育樹構建。

1.2.2 室內離體活性測定

從煙草根結線蟲病煙田取發病根結并用清水沖洗干凈，剪成0.5～1.0 cm小段，1%（質量分數）次氯酸鈉消毒2 min，用玻璃棒拍打、收集卵粒，經無菌水沖洗并離心得2 000粒/mL的卵粒懸液，將卵粒懸液置于28℃的恒溫箱中孵化5～7 d后收集二齡幼蟲，經沖洗與離心得2 000條/mL的線蟲懸液。將TB-68菌株接種于NB培養基，28℃，160 r/min振蕩培養16 h后，10 000 r/min離心2 min，用0.22μm的微孔濾膜濾除菌體，得發酵濾液原液，并依次稀釋制備5倍和10倍稀釋液。分別測定發酵濾液原液、5倍和10倍稀釋液對根結線蟲二齡幼蟲的致死作用和對卵孵化的抑制作用。具體方法：吸取200μL菌株發酵濾液加入到1.5 mL離心管中，再向其中加入50μL線蟲懸液混合均勻，以空白液體培養基為對照，重復6次，置于25℃培養箱中，48 h后觀察二齡幼蟲的死亡情況，通過滴加4%（質量分數）NaOH溶液判斷線蟲的死活［20]，計算線蟲死亡率和校正死亡率［21]。吸取200μL菌株發酵濾液和50μL卵懸液至1.5 mL離心管中，以空白液體培養基為對照，每處理重復6次，置于25℃恒溫箱中培養，7 d后調查各處理中孵化出的二齡幼蟲的數量，計算孵化率和卵孵化抑制率［21]。

1.2.3 室內盆栽防效測定

將TB-68菌株接種于NB液體培養基，28℃，160 r/min振蕩培養至OD值為0.8～1.0，得TB-68發酵液。采用漂浮育苗，待煙苗長到5～6片真葉時，選取健壯、長勢一致的幼苗移栽于裝有無菌土的花盆（10 cm×12 cm）中，每盆移栽1株煙苗，移栽3 d后進行灌根和施藥處理，具體方法：（1）TB-68發酵液100 mL/株灌根；（2）TB-68發酵液200 mL/株灌根；（3）0.5%（質量分數）阿維菌素顆粒劑2 g/株穴施；（4）空白培養基對照。灌根和施藥5 d后接種根結線蟲，在距離煙草根2 cm處的無菌土中對稱打2個1 cm深的小孔，注入二齡幼蟲懸液，每株接種1 000條。每處理10個重復，澆透水后放在28℃人工氣候室內培養，移栽60 d后，根據GBT23222—2008煙草病蟲害分級及調查方法進行病情調查，并計算根結指數和防治效果［22]。

根結指數＝Σ（各級病株數×級別）/調查總株數

防治效果＝（對照根結指數-處理根結指數）/對照根結指數×100%

1.2.4 TB-68菌株生防機理初步研究

將從病田取回的根結用清水沖洗干凈，剪成0.5 cm的小段，在體視鏡下用滅菌的牙簽輕輕挑取卵囊，用1%（質量分數）次氯酸鈉表面消毒1 min，用無菌水沖洗3次。參考1.2.2方法制備TB-68發酵濾液原液，測定TB-68發酵濾液處理對根結線蟲卵囊總糖和總蛋白含量的影響。各處理取飽滿且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL離心管中，每管加入1 mL TB-68發酵濾液，以加入等量的無菌LB培養基為對照，密封置于25℃培養箱中培養24 h，按照說明書要求測定卵囊總糖和總蛋白的含量（質量分數），重復3次。

1.3 數據分析

采用SPSS 25.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析，利用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

在NA培養基上培養15 h，TB-68菌株的菌落均呈乳白色不透明、表面粗糙、質地緊密、中央有凹陷、邊緣不規則形態，菌體呈短桿狀，大小為2.33μm×0.58μm，革蘭氏染色陽性，芽胞中生（圖1）。測定TB-68菌株的16S rDNA的序列，經與NCBI數據庫進行BLAST比對分析，相似性最高的為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。利用其近緣序列構建系統發育樹。結果顯示，TB-68菌株與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）處于進化樹的同一分支（圖2），結合形態學特征，將TB-68菌株鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。

2.2 TB-68菌株對煙草根結線蟲的室內離體活性測定

由表1可見，隨著TB-68菌株發酵濾液稀釋倍數的增加，線蟲的死亡率逐漸降低，卵孵化率逐漸增高。其中，TB-68發酵濾液原液處理中根結線蟲二齡幼蟲的死亡率達94.5%，顯著高于其他處理和對照，校正死亡率達91.7%，其5倍稀釋液和10倍稀釋液處理中的線蟲死亡率也顯著高于對照，校正死亡率分別為67.2%和39.2%。此外，TB-68菌株發酵濾液原液處理中的卵孵化率最低，為12.8%，而對照中的卵孵化率為70.5%；卵孵化抑制率達到81.8%，5倍稀釋液和10倍稀釋液處理的卵孵化抑制率分別為59.6%和39.4%。

表1 TB-68菌株發酵濾液對根結線蟲的室內離體活性測定①Tab.1 In vitro activity test of TB-68 fermentation filtrate on tobacco root knot nematode in greenhouse （%）

2.3 室內盆栽防效測定

室內盆栽試驗發現（表2），TB-68發酵液200 mL/株灌根處理和100 mL/株灌根處理對煙草根結線蟲均有一定的防治效果，根結指數均明顯低于對照。其中，TB-68發酵液200 mL/株灌根處理的根結指數為27.9，防治效果達64.4%，接近0.5%阿維菌素的防治效果；TB-68發酵液100 mL/株灌根處理的根結指數為38.6，防治效果為50.8%。由此可見，TB-68菌株具有較好的生防潛力。

表2 TB-68菌株對南方根結線蟲盆栽防治效果的影響Tab.2 Control efficiency of TB-68 strain against Meloidogyne incognita in pots

2.4 TB-68菌株發酵濾液對根結線蟲卵囊總糖和總蛋白含量的影響

由圖3可見，TB-68發酵濾液處理24 h后，根結線蟲卵囊總糖含量和總蛋白含量分別為8.1 g/L和22.1 g/L，對照組根結線蟲卵囊總糖和總蛋白含量量分別為14.9 g/L和50.6 g/L，分別比對照顯著降低45.6%和56.3%，說明TB-68菌株發酵濾液處理能夠顯著降低根結線蟲卵囊的總糖含量和總蛋白含量。

3 討論

本研究中鑒定前期從煙草根結線蟲卵囊上分離得到的生防細菌TB-68菌株為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），并發現TB-68菌株發酵液200 mL/株的灌根處理對煙草根結線蟲病的室內防治效果較高（64.4%），接近0.5%阿維菌素2 g/株穴施處理的防治效果，可為煙草根結線蟲病的防控提供新的生防資源，對該病的綠色防控具有重要意義。此外，生防菌株的定殖能力是其發揮防效的前提，也是評價該菌株生防潛力的重要因素［23]。根據Al-Ali等［24]的研究，貝萊斯芽胞桿菌在番茄根際周圍具有較強的定殖能力，從而表現出良好的防治效果，推測本研究中TB-68菌株在煙田中較高的防效可能與TB-68菌株在煙草根際土壤的穩定定殖能力有關，下一步將驗證TB-68菌株的田間防治效果及其在土壤中的定殖能力，以期為TB-68菌株的開發利用提供依據。

本研究中還發現貝萊斯芽胞桿菌TB-68發酵濾液對煙草根結線蟲二齡幼蟲具有較強的致死作用，且對其卵囊孵化具有較強的抑制作用，推測TB-68菌株發酵產生的次級代謝產物對根結線蟲具有較強的生物活性，從而抑制煙草根結線蟲病的發生。另外，研究中發現TB-68發酵濾液能夠顯著降低線蟲體內的總糖和總蛋白含量。糖是線蟲化學感受器的重要組成物質進而影響著線蟲的趨向性，線蟲體表的蛋白質角質層可保持線蟲體內水分穩定并能阻止生防菌或其他有害物質的侵入［25]。因此，TB-68菌株很可能是通過其發酵濾液干擾線蟲糖和蛋白質的代謝活動，破壞了煙草根結線蟲卵和二齡幼蟲的體壁及內部結構組成，進而導致線蟲死亡，該推測與Choi等［26]報道的結果相符。

4 結論

從煙草根結線蟲卵囊上分離得到的1株生防細菌TB-68，通過形態及分子特征分析將其鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。該菌株發酵濾液原液對根結線蟲二齡幼蟲的校正死亡率達91.7%，卵孵化抑制率達到81.8%，室內盆栽防治效果達64.4%，并能顯著降低根結線蟲卵囊總糖和總蛋白含量，在煙草根結線蟲病的生物防治方面具有較大應用潛力。