不同香型烤煙中Amadori化合物測定及多元統計分析

馬立超，李登科，張春濤，于 潔，魏鵬程，田志章，許 峰，吳若昕，邢立霞，田 楠*

1.上海煙草集團有限責任公司技術中心天津工作站，天津市東麗區成林道319號 300163 2.上海煙草集團有限責任公司技術中心，上海市浦東新區秀浦路3733號 201315

在煙草調制、醇化及烘焙等加工過程中會發生Maillard反應，其中葡萄糖與氨、氨基酸反應生成的Amadori化合物，占到烤煙干質量的1.5%～2.0%［1-3]。Amadori化合物在常溫下化學性質較穩定、沒有氣味，但在烤煙加工、燃吸過程中裂解后會產生具有芳香氣味的小分子化合物，可改善吃味、柔和煙氣、增加烘烤香和甜香［4-5]。因此，分析其在烤煙中的質量分數對評價煙葉品質具有重要的意義。

Amadori化合物極性強、種類多、結構相似且無強發色基團，分析難度較大［6-7]。目前，國內外對Amadori化合物的分析主要采用氣相色譜-質譜聯用法［8]、高效液相色譜法［9]、離子交換色譜法［10]、高效陽離子色譜-質譜法［11]、配體交換-掃描毛細管電泳-紫外檢測法［12]、分子印跡富集分離-質譜和毛細管電泳檢測法［13]，但這些方法存在需要衍生化、選擇性差和檢測通量低等缺點。液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）具有高靈敏度、高選擇性和高通量分析的優勢，廣泛用于中草藥［14-15]、食品［16]、煙草［17-22]等復雜基質樣品的分析與研究，已逐漸成為檢測煙草中Amadori化合物的主要手段［6-7，20-22]，但采用該方法測定出的Amadori化合物與烤煙香型的關系研究則未見報道。因此，采用LC-MS/MS法對8種不同香型烤煙中11種Amadori化合物進行同時測定，并結合主成分分析（PCA）、層次聚類熱力圖分析（Hierarchical clustering heat map analysis，HCHMA）及t分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）等多元統計分析方法，研究Amadori化合物與烤煙香型的關系，旨在為烤煙香型和產地分析、煙葉品質評價、配方設計優化提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

8種香型烤煙典型產區［23]（云南、貴州、福建、河南、重慶、湖南、山東、黑龍江）的2017年中部煙葉樣品，共計69個。

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、乙酸（>98%，北京百靈威科技有限公司）；鹽酸（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；葡糖胺（Glucosamine，98%，美國Alfa Aesar公司）；1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro，97%）、1-脫氧-1-L-谷氨酸-D-果糖（Fru-Glu，93%）、1-脫氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala，95%）、1-脫氧-1-L-纈氨酸-D-果糖（Fru-Val，95%）、1-脫氧-1-L-異亮氨酸-D-果糖（Fru-Ile，96%）、1-脫氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu，98%）、1-脫氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe，95%）、l-脫氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp，95%）（加拿大TRC公司）；1-脫氧-1-L-組氨酸-D-果糖（Fru-His，95%）、1-脫氧-1-L-絲氨酸-D-果糖（Fru-Ser，95%）（上海淘普生物科技有限公司）。

1260-6420高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Agilent公司）；KQ-600DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；XS204電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler公司）；0.22μm有機針式過濾器（上海安譜實驗科技股份有限公司）；Z300離心機（德國Hermle公司）；Discovery?HS F5色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.0μm，美國Supelco公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

單一標準儲備溶液：分別準確稱取適量11種Amadori化合物的標準品，用10%（體積比）乙腈水溶液配制成濃度均為500μg/mL的單一標準儲備溶液，于4℃冰箱中保存。

混合標準儲備溶液：移取Fru-Pro、Fru-Ala單一標準儲備溶液各2 000μL，移取其他9種Amadori化合物單一標準儲備液各400μL，混合后用10%乙腈水溶液定容至50 mL，得到濃度分別為20μg/mL（Fru-Pro、Fru-Ala）、4μg/mL（其他9種Amadori化合物）的混合標準儲備液，于4℃冰箱中保存。

混合標準工作溶液：分別取上述的混合標準儲備溶液25、50、250、500、1 000、5 000μL于10 mL容量瓶中，用10%乙腈水溶液定容。所配制的系列標準工作溶液中Fru-Pro和Fru-Ala的濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、10.00μg/mL，其余9種化合物濃度為0.01、0.02、0.10、0.20、0.40、2.00μg/mL。此溶液現配現用。

1.2.2 樣品前處理及分析

將烤煙樣品在30℃下干燥，直至可用手指捻碎，研磨后過425μm（40目）篩，裝入棕色廣口瓶中，混勻［24]。準確稱取300 mg煙末樣品于50 mL具塞錐形瓶中，加入9 mL 70%（體積比）甲醇水［0.1%（體積比）HCl]溶液，240 W功率下超聲萃取25 min，3 500 r/min下離心15 min，取200μL上清液以10%乙腈水溶液定容至10 mL，過有機針式過濾器后進行LC-MS/MS分析。分析條件：

色譜柱：Discovery?HS F5色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.0μm）；柱溫：40℃；進樣量：5μL；流動相A：0.1%（體積比）甲酸水溶液；流動相B：0.1%（體積比）甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～2 min 10%B，2～4 min 10%～100%B，4～7 min 100%B，7～9 min 100%～10%B，9～20 min 10%B；流速：0.3 mL/min。離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離模式：正離子模式，多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：4 000 V；碰撞氣：N2；霧化器壓力：206.85 kPa（30 psi）；干燥氣溫度：350℃，流速：11 L/min；碎裂電壓、碰撞電壓、碰撞池加速電壓如表1所示。

表1 11種Amadori化合物的多反應監測模式參數Tab.1 MRM parameters of 11 Amadori compounds

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

以各Amadori化合物準確的［M+H]+（M代表Amadori化合物）峰為母離子，進行MRM模式的二級質譜優化，重點優化碎裂電壓、碰撞電壓和碰撞池加速電壓。選出豐度較高的二級碎片離子［M+H-H2O]+、［M+H-2H2O]+、［M+H-H2O-CO]+、［M+H-C5H10O5]+或［AA+H]+（AA代表氨基酸）作為定量離子和輔助定量離子［6]。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

五氟苯丙基鍵合固定相（PFP）色譜柱呈現出多重保留機制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性，可以增強對難分離化合物的分離效果［16]。使用Discovery?HS F5 PFP色譜柱，采用LC-MS/MS法同時測定烤煙中的11種Amadori化合物，實現了同分異構體Fru-Ile與Fru-Leu的最佳分離，標準溶液MRM譜圖如圖1所示。

2.2.2 流動相體系的選擇

在ESI源正離子模式下，流動相中加入甲酸有利于Amadori化合物的胺基質子化，提高離子化效率［6-7]。首先，分別考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈流動相體系對Amadori化合物的分離效果。結果表明，Amadori化合物在0.1%甲酸水溶液-乙腈體系中的分離效果更好。在此基礎上，考察了甲酸添加量的影響，比較了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.2%甲酸水溶液-乙腈、水-0.1%甲酸乙腈、水-0.2%甲酸乙腈、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈5種流動相體系對Amadori化合物的分離效果。其中，第2和第5種流動相體系對Amadori化合物的分離效果最好，質譜響應也最高。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動相體系中，Amadori化合物的峰形與分離效果更佳，同分異構體Fru-Ile與Fru-Leu的分離效果最優（如圖1所示），原因可能是甲酸在混合流動相中的比例保持恒定。后續研究中采用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動相體系。

2.3 前處理方法優化

2.3.1 萃取溶劑優化

煙葉中Amadori化合物的提取常用水、甲醇、甲醇水溶液、酸性水溶液等溶劑［6-7,20-22]。首先比較了水、50%（體積比，下同）甲醇水溶液、30%甲醇水溶液、甲醇、70%甲醇水溶液的萃取效果，如圖2中條件1～5所示（Fru-Pro、Fru-Ala質量分數較高，對應左縱坐標軸，其他化合物對應右縱坐標軸，圖3情況相同），其中70%甲醇水溶液的萃取效果較好。

在70%甲醇水溶液中分別加入0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%鹽酸（均為體積比），能有效提高溶劑萃取效果，如圖2中條件6～8所示。原因可能是加入的酸與Amadori化合物的胺基部分反應生成鹽，增大了Amadori化合物在萃取液中的溶解度。其中加入0.1%鹽酸萃取效果最好，可能是因為鹽酸的酸性最強。

2.3.2 萃取時間

比較了不同萃取時間對11種Amadori化合物萃取量的影響。分別萃取10、15、20、25、30 min的結果（圖3）表明，25 min時已基本萃取完全，繼續延長萃取時間，萃取量提高不明顯。

2.4 基質效應的評價

在LC-MS/MS中，基質效應（Matrix effect，ME）對檢測結果可靠性和準確性的影響不容忽視。補償基質效應的方法主要有基質凈化法、同位素標記法、基質匹配校準法、稀釋法等［25-26]。本研究中采用稀釋法進行校準來消除基質效應，取1 mL 1.2.2節離心后的萃取液（稀釋因子?取1）分別用10%乙腈水溶液稀釋定容至20、50、100、200 mL（?分別取20、50、100、200），得到4種不同稀釋因子的基質溶液［26-27]。以稀釋的基質溶液為溶劑，配制得到0.10μg/mL的4個稀釋因子下的基質標準點；以10%乙腈水溶液為溶劑，配制得到0.10μg/mL的溶劑標準點；每個濃度點平行配制3組。基質效應的計算公式：

式中：A和B分別表示基質和溶劑標準點的峰面積。

ME>0時，表示基質對待測物有增強效應；ME<0時，表示基質對待測物有抑制效應。|ME|≤20%，可認為該基質效應微弱；20%＜|ME|≤50%，表示基質效應中等；若|ME|>50%，則表明基質效應很強［25，28]。本研究中基質對10種Amadori化合物表現為基質抑制效應，僅對Fru-Trp表現為基質增強效應。

結果（表2）表明：?取20時，|ME|≤15.7%；?取50倍及以上時，|ME|≤10.1%，在2.5.2節中通過回收率進一步考察基質效應的影響，結果均在可接受的范圍內。綜合考慮目標化合物響應情況及基質效應，最終選取?=50。

表2 不同稀釋因子下基質溶液的基質效應（|ME|）（n=3）Tab.2 Matrix effect（|ME|）of matrix solution with different dilution factors（n=3）

2.5 方法學評價

2.5.1 工作曲線和檢測限

對系列標準工作溶液進行LC-MS/MS分析，以目標化合物的質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。對低濃度混合標準溶液稀釋后進行測定，分別以3倍和10倍信噪比作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。由表3可知：方法的線性關系良好（r＞0.995），檢出限低（1.0～10.0 ng/mL），可用于烤煙中11種Amadori化合物的同時測定。

表3 線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Tab.3 Linear equations,correlation coefficients,linear ranges,LODs and LOQs

2.5.2 回收率和精密度

對已知Amadori化合物質量分數的烤煙樣品進行加標回收率實驗，測定目標物在低、中、高3個水平下的回收率。如表4所示，各目標物的回收率在87.8%～110.2%之間，說明本方法較可靠。

表4 加標回收率、日內和日間精密度（n=6）Tab.4 Standard recoveries,intra-and inter-day RSDs（n=6）

將烤煙樣品按1.2節中的方法進行處理和檢測，每天測定6次，連續測定6 d，考察方法的精密度（RSD）。如表4所示，日內和日間RSD分別在1.1%～4.8%和2.9%～9.6%之間，說明方法的精密度和穩定性較好。

2.6 實際樣品測定

8種不同香型烤煙69個樣品的定量分析結果見表5。從Amadori化合物總量上看，清甜香型（云南）烤煙中的質量分數最高；蜜甜香型（貴州）、木香蜜甜香型（黑龍江）和焦甜醇甜香型（湖南）烤煙次之，醇甜香型（重慶）、蜜甜焦香型（山東）烤煙中等，清甜蜜甜香型（福建）、焦甜焦香型（河南）烤煙較低。清甜香型烤煙中還原糖和氨基酸的質量分數均較高［23]，因而Amadori化合物的質量分數最高；清甜蜜甜香型烤煙中氨基酸的質量分數較低、焦甜焦香型烤煙中還原糖質量分數較低［23]，分別導致了各自Amadori化合物的質量分數相對較低。此外，Amadori化合物質量分數還與煙草加工工藝及不同Amadori化合物反應動力學等密切相關［21,29-30]。

表5 烤煙樣品中11種Amadori化合物的質量分數（均值±標準偏差）Tab.5 Contents of 11 Amadori compounds in flue-cured tobacco samples（Means±SD） （μg·g-1）

2.7 主成分分析

將得到的Amadori化合物數據采用R語言Princomp程序包進行主成分分析［31-32]，KMO和Bartlett’s球形檢驗結果：KMO=0.689（＞0.5），Bartlett’s球形檢驗Sig.=0.000（＜0.05），適合進行主成分分析［33-34]。PC1獨立貢獻率為37.82%，主要 反 映 來 自Fru-His（0.790）、Fru-Glu（0.813）、Fru-Leu（-0.759）、Fru-Ile（-0.736）、Fru-Trp（0.694）的信息；PC2獨立貢獻率為22.18%，主要反映的是來 自Fru-Pro（0.804）、Fru-Ala（0.657）、Fru-Phe（-0.718）、Fru-Ser（0.566）的信息；PC3獨立貢獻率為12.99%，主要反映的是來自Fru-Ile（0.528）、Fru-Val（0.503）、Fru-Glu（0.438）、Fru-His（0.396）的信息，累計貢獻率72.99%。上述結果表明，通過PCA所提取的主成分能夠代表8種不同香型烤煙中的Amadori化合物的主要信息。

PCA得分如圖4所示，Amadori化合物對烤煙香型的分類具有重要作用：不同香型烤煙分類效果較好，能清晰地反映不同香型烤煙特征。PCA得分圖中部分產區烤煙香型較為分散，可能是同一大產區下烤煙種植較為分散，導致不同小產區可能分屬于不同香型，如以蜜甜香型為特色的貴州產區，畢節西部、黔西南西部、六盤水西部烤煙屬于清甜香型，與云南東部烤煙品質極為接近；以焦甜醇甜香型為代表的湖南產區，湘西、張家界、懷化、常德等地的烤煙則屬于醇甜香型，與重慶產區烤煙品質極為接近；以焦甜焦香型為特色的河南產區，烤煙種植較為分散，包括許昌、平頂山、駐馬店、南陽、洛陽、三門峽等地，因而在PCA得分圖上較為分散［23]。

2.8 層次聚類熱力圖分析

將得到的Amadori化合物數據采用R語言Pheatmap程序包進行分析，Z-Score數據標準化后，采用組間連接法，以歐氏距離為指標進行層次聚類熱力圖分析［31-32]，如圖5所示。

熱力圖中紅色表示Z-Score得分較高，質量分數相對較高，藍色表示Z-Score得分較低，質量分數相對較低。清甜蜜甜香型烤煙中Fru-Val、Fru-Leu、Fru-Ile質量分數相對較高；蜜甜焦香型、焦甜焦香型烤煙中Fru-Phe、Glucosamine質量分數相對較高；清甜香型烤煙中Fru-Pro質量分數相對較高；蜜甜香型烤煙中Fru-Glu、Fru-Ser、Fru-His質量分數相對較高；焦甜醇甜香型烤煙中Fru-Ala、Glucosamine質量分數相對較高；醇甜香型烤煙中各Amadori化合物質量分數相對中等；木香蜜甜香型烤煙中Fru-Pro、Fru-Ala和Fru-Phe的質量分數相對較高。

HCHMA將69個烤煙樣品分為8大類；第Ⅰ類是S22～S30號樣品（產區福建，清甜蜜甜香型）；第Ⅱ類是S31～S38和S40號樣品（產區河南，焦甜焦香型），同樣產自河南的S39、S41號樣品歸入第Ⅲ類，可能是因為河南、山東產區生態氣候較為接近；第Ⅲ類是S55～S60號樣品（產區山東，蜜甜焦香型）；第Ⅳ類是S13～S21號（除S14號）樣品（產區貴州，蜜甜香型），S14號樣品中Amadori化合物質量分數較高，歸入第Ⅴ類；第Ⅴ類是S1～S12號（除S8號）樣品（產區云南，清甜香型），Amadori化合物質量分數最高，S8號樣品歸入第Ⅳ類；第Ⅵ類是S42～S47號樣品（產區重慶，醇甜香型），Amadori化合物質量分數居中；第Ⅶ類是S49～S54號（產區湖南，焦甜醇甜香型），S48號樣品可能來自于湘西北產區（湘西、張家界、懷化、常德等地），列入第Ⅵ類；第Ⅷ類是黑龍江產區（木香蜜甜香型），樣品中Amadori化合物質量分數較高。與烤煙樣品的原香型、產地進行對比，其分類準確率達到91.3%，說明根據Amadori化合物測定結果結合層次聚類熱力圖分析可以對烤煙香型進行較好分類。

2.9 t分布隨機鄰域嵌入

t-SNE是一種用于探索高維數據的非線性降維流形學習算法，核心思想是用概率分布代替歐式距離來度量樣本數據間的相似性，使其在高維空間和低維空間的概率分布無限接近，相似對象有更高的概率被選擇而聚集在一起，最終將多維數據降低至二維或三維，對數據進行可視化展示［31，35]。流形學習算法拓展了傳統多元統計分析方法的范疇，具有較好的應用價值。

將得到的Amadori化合物數據采用R語言Rtsne程序包進行t-SNE分析［31-32]，結果如圖6所示：同產區的烤煙樣品數據點較為集中，類內散度遠小于PCA結果，分類效果更具優勢。Amadori化合物質量分數較高的產區聚集在圖6上部，其中云南、貴州處于右上部，黑龍江、湖南處于左上部，重慶居中；質量分數較低的產區（河南、山東、福建）聚集在圖6的右下部；達到了“同類相近，異類相遠”的效果。湖南產區的煙葉種植地區較分散，烤煙香型不同，有一個樣本落入重慶產區，推測其產地可能為湘西北地區（湘西、張家界、懷化、常德等地）［23]。

3 結論

①建立了烤煙中11種Amadori化合物的LC-MS/MS分析方法。本方法的LODs為1.0～10.0 ng/mL，日內、日間RSDs分別為1.1%～4.8%和2.9%～9.6%（n=6），回收率為87.8%～110.2%，基質效應|ME|≤10.1%（?≥50）。②結合PCA、HCHMA及t-SNE等多元統計分析方法，研究Amadori化合物與烤煙香型的關系，發現不同香型烤煙具有明顯的分類趨勢，69個樣品可劃分為8類，t-SNE分析的區分效果更明顯，HCHMA結果中香型與產地的對應準確率達91.3%。③Amadori化合物測定結果結合多元統計分析方法，可為烤煙香型和產地分析、煙葉品質評價、配方設計優化提供技術支持。