阿帕替尼對胃癌細胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影響研究▲

宋錦添 陳奕貴* 鄭亮 蔡雄超 王益

福建醫科大學附屬腫瘤醫院&福建省腫瘤醫院，1 腹部腫瘤內科，2 腹部腫瘤外科，福州市 350014

胃癌，僅次于肺癌，是全球第2大癌癥死亡原因[1]。胃癌患者被確診時通常已處于晚期，多已發生遠處轉移，預后較差，中位生存期約為10～12個月[2]。臨床上治療晚期胃癌患者最常用的化療藥物是人表皮生長因子受體2(HER2)靶向藥物，但該類藥物具有很強的細胞毒性，患者惡心嘔吐、骨髓抑制和脫發等副作用嚴重[3]。腫瘤血管生成在腫瘤發生過程中的作用越來越受到人們的關注[4]。血管內皮生長因子(VEGFs)是血管形成過程中的關鍵調節因子，與受體酪氨酸激酶(RTK)結合后稱為VEGFR1-R3[5-6]。血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)可以作為靶向位點用于癌癥治療藥物的研發[7-10]。阿帕替尼是我國自主研發的一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，可以特異性與細胞內VEGFR2的ATP結合位點結合，阻斷下游信號轉導，抑制腫瘤新生血管的生成[11]。阿帕替尼有抗多種實體瘤的作用，包括肝細胞癌、非小細胞肺癌和晚期卵巢癌等[12-15]。在我國進行的胃癌Ⅱ期臨床研究結果顯示，阿帕替尼是一種治療胃癌的有效藥物[16]。為探討阿帕替尼治療胃癌的作用機制，本研究就阿帕替尼對胃癌細胞增殖、凋亡和VEGFR通路的影響進行了研究，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 胃癌細胞系HGC-27(貨號：TCHu 22)和NCI-N87(貨號：SCSP-534)購自中國科學院細胞庫(上海)，將其置于10% FBS的RPMI-1640培養基(Gibco，貨號：31800022)中，在37℃、5% CO2的環境下培養。收集第3代對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，根據實驗設計方案對細胞進行相應處理。稱取50 mg阿帕替尼溶于二甲基亞砜(DMSO) 1 mL后放入-20 ℃冰箱保存，使用時用RPMI-1640培養基稀釋至所需濃度。

1.2 CCK-8細胞增殖試驗 使用Cell Counting Kit-8試劑盒(上海Beyotime)檢測細胞增殖情況。對NCI-N87和HGC-27細胞分別設置對照組及加藥組(10 μM組，20 μM組，30 μM組，40 μM組，50 μM組)，每組設5個復孔。加藥組細胞給予不同濃度的阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)處理，對照組細胞加相同體積的培養基，培養48 h后向每個孔中迅速加入10 μL CCK-8， 37 ℃孵育2 h后使用酶標儀(Bio-Rad，CA，USA)檢測每個孔450 nm處的吸光度。

1.3 克隆形成實驗 取對數生長期的NCI-N87和HGC-27細胞，常規離心收集，設對照組及加藥組，將細胞接種到6孔板(每孔1×103)中， 37℃、5%CO2的環境下培養24 h。對照組細胞給予1‰ DMSO處理，加藥組細胞分別給予10 μM、20 μM阿帕替尼處理，37℃、5% CO2的環境下培養2周。細胞集落用4%多聚甲醛固定30 min，之后用0.5%結晶紫染色30 min。用無菌水洗去染液，Odyssey掃描拍照，使用ImageJ軟件計算細胞克隆數。

1.4 流式細胞檢測 取對數生長期的NCI-N87和HGC-27細胞，在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，分為對照組和阿帕替尼處理組。對照組細胞給予1‰DMSO處理，阿帕替尼處理組細胞分別給予10 μM、20 μM阿帕替尼處理。48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，用FITC-Annexin V/PI試劑(Roche，Basel，Switzerland)對細胞進行染色，用流式細胞儀(BD Biosciences，San Jose，USA)檢測凋亡細胞情況。

1.5 Western blot NCI-N87及HGC-27細胞給予10 μM和20 μM阿帕替尼處理，分組。對照組細胞給予1‰ DMSO處理，48 h后收集細胞于1.5 mL EP管中，使用SDS裂解液裂解細胞，使用BCA分析試劑盒(Bio-Rad，Hercules，美國)測量蛋白質濃度。10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質，然后轉移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，放入預先配好的Bcl-2(ab32124，1 ∶1000)、Bax(ab32503，1 ∶1 000)、Caspase 3(ab13847，1 ∶500)、Cleaved-Caspase 3(ab2302，1 ∶500)和內參β-Actin(ab8227，1 ∶1 000)的一抗緩沖液中4℃孵育過夜。用TBST洗滌30 min后室溫孵育二抗IgG H&L(ab6721，1 ∶3 000)1 h，用TBST緩沖液洗滌30 min。使用增強的化學發光檢測系統(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶灰度值。

采用膜蛋白抽提試劑盒(貨號：444810，Sigma-Aldrich，Darmstadt，Germany)檢測VEGFR2蛋白水平，根據試劑盒說明書進行操作。一抗選擇VEGFR2(ab134191，1 ∶1 000)，二抗選擇IgG H&L(ab6721，1 ∶3000)，內參選擇NaK ATPase(ab58475，1 ∶500)。抗體均購自Abcam(上海，中國)，一抗均為兔抗，二抗均為山羊抗兔。使用增強的化學發光檢測系統(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶灰度值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 阿帕替尼抑制胃癌細胞的增殖 用不同濃度阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)分別處理NCI-N87及HGC-27細胞48 h，NCI-N87、HGC-27細胞存活率隨著阿帕替尼濃度增高而降低，見圖1A。根據48 h時的IC50值(圖1B)選用10 μM和20 μM的阿帕替尼進行后續實驗。分別用10 μM和20 μM的阿帕替尼處理NCI-N87及HGC-27細胞2周，隨著阿帕替尼濃度的增高，NCI-N87及HGC-27細胞克隆數逐漸下降(圖1C)。

圖1 阿帕替尼抑制胃癌細胞增殖情況

2.2 阿帕替尼誘導胃癌細胞凋亡 流式細胞檢測結果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細胞凋亡率顯著增加，見圖2A。Western blotting結果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細胞的Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高， Cleaved-Caspase3表達水平升高，見圖2B。

圖2 阿帕替尼誘導胃癌細胞凋亡情況

2.3 阿帕替尼對胃癌細胞VEGFR通路的影響 Western blotting結果顯示，隨著阿帕替尼濃度升高，NCI-N87及HGC-27細胞的VEGFR2蛋白表達水平均下降，見圖3。

圖3 Western blot檢測VEGFR2蛋白表達水平

3 討 論

胃癌是世界范圍內最常見的癌癥之一，晚期胃癌患者病情進展迅速、預后極差，一直是臨床治療的難題[17]。我國自主研發的阿帕替尼在胃癌患者的臨床治療中表現出具有顯著的療效[18]。為深入探討阿帕替尼治療胃癌的作用機制，本研究就阿帕替尼對胃癌細胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影響進行了研究。

細胞增殖與腫瘤性疾病的發生發展密切相關[19]。本研究結果顯示，NCI-N87、HGC-27細胞的存活率、細胞克隆數隨著阿帕替尼濃度的增高而降低，提示阿帕替尼具有抑制胃癌細胞增殖的作用。細胞凋亡在調節細胞存活和維持其穩態中具有重要意義，目前有很多藥物是通過促進細胞凋亡來實現其抗癌作用，如長春新堿即是通過阻滯細胞的有絲分裂進而導致細胞凋亡而達到治療癌癥的目的[20-21]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，具有明顯的抑制細胞凋亡的作用；而Bax是一種促凋亡蛋白，可以促進細胞凋亡。當細胞凋亡啟動時，Caspase 3會轉變為有活性的 Cleaved-Caspase 3，參與細胞凋亡過程。本研究結果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細胞凋亡率顯著增加，Bcl-2表達水平降低，Bax、Cleaved-Caspase3表達水平升高，提示阿帕替尼可促進胃癌細胞凋亡。VEGFR是血管內皮生長因子受體，對腫瘤細胞的血管生成有重要作用[22]。本研究結果顯示，隨著阿帕替尼濃度的升高，NCI-N87及HGC-27細胞的VEGFR2蛋白表達水平下降，提示阿帕替尼對胃癌細胞VEGFR通路具有抑制作用，可阻斷下游信號傳導，從而抑制腫瘤新生血管的生長。

綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細胞增殖，同時具有促進胃癌細胞凋亡和抑制VEGFR通路的作用。