氧化石墨烯對紫花苜蓿抗病生理生態特征的影響

魏宏達，趙樹蘭，多立安

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

豆科根瘤能夠共生固氮，是全球生物固氮的主體，具有非常重要的生態價值.紫花苜蓿（Medicago sativa）是全世界種植范圍最廣的一種豆科牧草，具有其他牧草不能比擬的抗逆性強、品質好、產量高、經濟價值高等特點.近年來雖然紫花苜蓿的種植面積不斷擴大，但病害也經常發生，造成產量和品質下降，甚至會導致家畜中毒.如何更好地進行紫花苜蓿病害防控，增強其抗病性，對于提高紫花苜蓿的產量和品質極為重要.

植物在遭受病原微生物侵害時，自身可通過生理、生化、形態特征等多方面的變化產生抗病性[1].苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶是與植物抗病相關的3種極其重要的酶，可作為植物抗病性的重要生理指標.Duba等[2]研究小麥受病原菌侵染后體內PAL的變化，發現小麥感染病原菌后PAL活性顯著升高，抗病能力增強.Wilson等[3]研究也表明，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶普遍存在于高等植物體內，具有抵抗病原菌侵害的作用.另外，植物體內木質素、富含羥脯氨酸糖蛋白（hydroxyproline-rich glycoprotein，HPRG）及類黃酮等物質也與植物抗病性密切相關.Yao等[4]研究發現，類黃酮可以提高番茄對黃化曲葉病毒的抗性并抑制病毒傳播.Deepak等[5]研究發現，木質素和HPRG含量提高可使細胞壁發生木質化，形成物理和化學屏障，增強植物細胞壁抵抗病原菌穿透的能力.

石墨烯（graphene）作為新型碳納米材料，具有獨特的理化特性，在很多領域應用廣泛.氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一種石墨烯的重要衍生物，除了具有石墨烯的優良性能外，表面含有較多的含氧基團，使其在環境保護領域也得到了廣泛應用[6].另外，GO在治療腫瘤和中樞神經系統疾病等方面也表現出良好的應用前景[7].然而，GO用量的增加對生物和環境造成的風險也在增加，并引起廣泛關注，一些針對GO對植物生長影響的研究已經展開.Begum等[8]研究發現，GO顯著抑制了白菜、番茄和紅菠菜根、莖的生長，且隨著GO濃度的增加，抑制作用增強.Wang等[9]研究也表明高濃度GO顯著降低了大豆種子發芽率以及根和幼苗的干質量.但也有報道，GO對番茄種子的萌發具有促進作用，顯著提高了種子發芽率[10].可見，GO對植物的影響很大程度上取決于GO濃度和植物種類.植物在生態系統中至關重要，研究GO對植物抗病生理生態特征的影響具有重要意義.

Hu等[11]研究認為，GO對植物的抗病性會產生負面影響.一方面，高濃度GO可對植物造成脅迫，引起植物體的氧化應激反應，致使體內活性氧大量增加；另一方面，GO脅迫會抑制植物抗氧化酶系統對活性氧的清除，過量的活性氧會直接攻擊蛋白質和脂質等大分子物質，引起脂質過氧化，造成機體損傷，從而增加植株感染病原菌的風險[12].而有關GO對植物抗病性影響的研究還未見文獻報道.本文選取豆科植物紫花苜蓿為研究對象，研究土培條件下GO對紫花苜蓿抗病生理生態特征的影響，為揭示GO存在下豆科植物抗病生理的作用機制提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤為天津師范大學校園土，主要理化性質：含水質量分數為16.5%，電導率為1 950μS/cm，速效磷含量為23.2 mg/kg，速效鉀含量為473.7 mg/kg，水解氮含量為218 mg/kg，pH值為7.14.紫花苜蓿種子購自于天津市曹莊花卉市場.氧化石墨烯購自于蘇州恒球石墨科技有限公司，厚度為3.5～7.0 nm，片層直徑為10～50μm，比表面積為100～300 m2/g.

1.2 研究方法

1.2.1 植株培養

采用高18 cm、上直徑20 cm、下直徑15 cm的花盆為培養容器.每盆裝土2.3 kg，GO分別按照0.2%、0.4%和0.6%的質量分數添加，與土壤充分混勻.以不添加GO為對照（CK），每個處理重復4次.每盆中播種150粒大小均一且籽粒飽滿的紫花苜蓿種子.花盆隨機排列，經常移動位置以保證光照一致，培養期間按需補充水分.實驗期間環境溫度為14～25℃，相對濕度為15%～30%，光照為自然入射光.種子萌發后60 d測定相關指標.

1.2.2 株高、根長、地上生物量和根瘤數量的測定

選取長勢良好、均勻的植株，用直尺測量株高和根長.將收獲的植物地上部分用蒸餾水洗凈并用濾紙吸水后，在108℃下殺青20 min，80℃下烘干至恒重，稱量.采用計數法測定根瘤數量.

1.2.3 抗病相關酶活性的測定

參照Lister等[13]的方法測定PAL活性.取新鮮葉片1.0 g，加入聚乙烯吡咯烷酮0.1 g、5 mmol/L巰基乙醇硼酸緩沖液5 mL和少量石英砂，在冰浴下研磨成漿，4℃下8 000 r/min離心15 min.取上清液0.1 mL，加入3 mL濃度為0.02 mol/L的苯丙氨酸硼酸緩沖液（pH值為8.8），加蒸餾水至6 mL，30℃保溫30 min.對照組以蒸餾水為底物.使用紫外分光光度計（UV-1700，Shimadzu，日本）測定290 nm處的OD值.以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活單位.

幾丁質酶活性測定參照Nguyen等[14]的方法并加以改進.取葉片0.4 g，加入0.1 mol/L的乙酸緩沖液（pH值為5.0）2 mL和少量石英砂，在冰浴下研磨成勻漿，4℃下12 000 r/min離心20 min.取上清液0.8 mL，加入0.2 mL膠態幾丁質，40℃水浴60 min后，加入0.3 mL的DNS，于沸水浴中顯色10 min.靜置冷卻至室溫，再加入2 mL蒸餾水，用紫外分光光度計在540 nm下測定OD值，以零反應時間作對照，以每分鐘產生1μmol還原糖所需酶量為1個酶活單位.

β-1，3-葡聚糖酶活性測定參照Kauffmann等[15]的方法.取0.2 g葉片，加入0.1 mol/L的乙酸緩沖液（pH值為5.0）2 mL，4℃下研磨成勻漿，10 000 r/min下離心10 min.兩次離心后，取1.0 mL上清液，加入1.0 mL昆布多糖溶液，在40℃下水浴30 min，沸水浴10 min后立即冷卻.與2.0 mL的DNS溶液混勻，用紫外分光光度計在550 nm下測定OD值.以每分鐘還原昆布多糖釋放出1μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活單位.

1.2.4 抗病相關物質含量的測定

參照Pirie等[16]的方法測定類黃酮含量.取葉片0.5 g，加入1%的HCl-甲醇溶液5 mL，在4℃下提取24 h.取0.5 mL提取液，用1%的HCl-甲醇溶液稀釋至10 mL，在325 nm下測定OD值，類黃酮含量用每克鮮質量下蘆丁的質量（單位為mg）表示.

參照Reddy等[17]的方法并稍作改進測定木質素含量.取葉片0.2 g，加入95%的乙醇3 mL，研磨成勻漿，于5 000 r/min下離心10 min.取出沉淀物，分別用正己烷和95%乙醇沖洗若干次，待沉淀物自然風干后，加入25%的溴乙酰-冰醋酸，65℃下水浴40 min，加入2 mol/L的氫氧化鈉0.9 mL和5 mL冰醋酸，1 000 r/min下離心10 min，用紫外分光光度計測定上清液280 nm處的OD值，以每克鮮質量的吸收值表示木質素含量.

參照Kivirikko等[18]的方法測定HRGP.細胞壁中的羥脯氨酸含量與HRGP含量呈正相關，因此，計算出羥脯氨酸的質量即可計算樣品中HRGP的質量分數.

1.3 數據處理與分析

采用SPSS19.0軟件對所得數據進行單因素方差分析，采用Duncan法在P=0.05水平進行差異統計學意義檢驗，采用Origin 2017軟件繪圖.

2 結果與分析

2.1 GO對紫花苜蓿株高、根長和地上干質量的影響

不同質量分數的GO處理下，紫花苜蓿株高、根長和地上干質量如圖1所示.由圖1可以看出，隨著GO質量分數的增加，紫花苜蓿地上干質量和株高均呈現降低的趨勢.0.2%GO處理下，紫花苜蓿的株高較對照組有所降低，差異不顯著（P＞0.05），地上干質量較對照組顯著降低（P＜0.05）.0.4%和0.6%GO處理組中，紫花苜蓿的株高和地上干質量均顯著低于對照組，且GO質量分數越大苜蓿生長狀況越差.GO質量分數為0.6%時，地上干質量和株高較對照組分別降低了26.7%和20.3%.GO對紫花苜蓿根長沒有顯著影響.

圖1 不同質量分數GO處理下紫花苜蓿的株高、根長和地上干質量Fig.1 Plant height，root length and shoot dry weight of M.sativa under different mass fraction of GO

2.2 GO對紫花苜蓿根瘤數的影響

添加不同質量的GO后，紫花苜蓿單株根瘤數變化如圖2所示.由圖2可以看出，隨著GO質量分數的增加，紫花苜蓿單株根瘤數下降，0.6%GO處理顯著抑制了根瘤數的增加（P＜0.05），抑制率為22.3%；0.2%和0.4%GO處理對根瘤數的影響不顯著.

圖2 不同質量分數GO處理下紫花苜蓿根瘤數Fig.2 Number of nodules of M.sativa under different mass fraction of GO

2.3 GO對紫花苜蓿抗病酶活性的影響

土壤中添加GO后，紫花苜蓿抗病酶活性變化如圖3所示.

圖3 不同質量分數GO處理下紫花苜蓿的抗病酶活性Fig.3 Disease resistance enzyme activity of M.sativa under different mass fraction of GO

由圖3可以看出，PAL活性隨GO質量分數的增加而降低，0.4%和0.6%處理出現了顯著的抑制作用（P＜0.05），抑制率分別為39.6%和65.7%；0.2%處理與對照組差異不顯著（P＞0.05）.GO抑制了幾丁質酶的活性，隨著GO質量分數的增加，抑制作用增強；0.2%和0.4%處理幾丁質酶活性抑制率分別為11.5%和38.1%，與對照組差異不顯著（P＞0.05），0.6%處理出現顯著抑制作用，抑制率為64.3%.GO對紫花苜蓿體內的β-1，3-葡聚糖酶活性沒有顯著影響.

2.4 GO對紫花苜蓿抗病物質含量的影響

土壤中添加GO后，紫花苜蓿抗病物質含量的變化如圖4所示.

圖4 不同質量分數GO處理下紫花苜蓿的抗病物質含量Fig.4 Content of other disease-resistant substances in M.sativa under different mass fraction of GO

由圖4可以看出，木質素含量隨著GO質量分數的增加而降低，0.4%和0.6%處理出現了顯著抑制作用，抑制率分別為31%和45.8%（P＜0.05）.GO對類黃酮含量沒有顯著影響，但顯著降低了HRGP含量，各處理組與對照組相比分別降低了12.6%、36.1%和47.9%.

3 討論與結論

PAL是植物體內苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶，其活性與植物抗病性密切相關.Solekha等[19]研究發現，水稻感染稻瘟病菌后抗病品種中PAL的活性顯著高于敏感品種的活性.本研究結果顯示，紫花苜蓿中PAL活性隨著土壤中GO質量分數的增加而降低，并且在高質量分數GO處理組中顯著降低，表明GO能夠抑制PAL的活性，且隨著GO質量分數的增加抑制作用增強.PAL活性的高低通常表示PAL基因表達量的多少，即PAL基因表達受到抑制PAL活性將會降低.Wang等[20]研究發現，GO能夠導致擬南芥根系發育相關基因表達下調.因此，可以推測GO抑制了PAL基因的表達從而導致PAL活性降低.木質素作為苯丙烷代謝途徑合成的重要次生代謝產物，在植物抵御病原微生物入侵的抗病反應中發揮著重要作用.本研究發現，GO處理降低了紫花苜蓿細胞壁的木質素含量，且隨著GO添加量的增加，木質素含量和PAL活性的變化趨勢完全一致，在高質量分數GO處理下二者均受到顯著抑制作用.Shalitin等[21]研究百日草中苯丙烷類代謝酶與木質素的關系，發現百日草細胞分化過程中，木質素的合成與PAL活性增加呈正相關.Kováˇcik等[22]用PAL活性抑制劑氨基茚磷酸（AIP）處理鋁脅迫下的母菊，發現其細胞壁木質素的含量顯著降低，這和本研究結果相一致.木質素含量的降低可能是由于GO下調了PAL基因的表達，從而抑制了PAL活性，致使苯丙烷代謝合成途徑受阻.類黃酮是一類重要的多酚類次生代謝物，具有抗疫酶活性，能夠顯著降低多種植物的發病率.類黃酮的合成途徑受PAL的間接調控，有研究證實兩者具有協同增減的趨勢[23].本研究發現，GO處理沒有顯著影響紫花苜蓿的類黃酮含量，類黃酮含量和PAL活性變化趨勢不同，兩者并沒有表現出一定的協同性，這與前人的研究結果有所不同.可能原因有兩方面：一是類黃酮的合成途徑不僅受PAL的間接調控，還受外界因素和其他相關酶的直接調控，GO抑制了PAL活性，但對其他直接調控類黃酮合成途徑的相關酶未造成顯著影響，因此并沒有引起類黃酮含量的變化；二是木質素合成受到抑制，導致代謝物改變方向進入類黃酮，引起類黃酮物質的增加，而這些增加的量可能恰好彌補了因GO抑制PAL活性導致類黃酮減少的量，因而類黃酮含量沒有發生變化.

HRGP是高等植物細胞壁中的一種特殊結構蛋白，可作為木質素沉積位點，增強細胞壁木質化程度，構成緊密的物理屏障阻止病原菌的穿透侵染.本研究結果顯示，在所設質量分數范圍內GO處理紫花苜蓿后HRGP含量顯著下降，表明GO抑制了HRGP合成，對紫花苜蓿細胞壁造成損傷.植物受到脅迫時通常伴隨著乙烯濃度的升高，乙烯對植物次生代謝產物的調控具有濃度依賴性，一定濃度的乙烯可以促進某些次生代謝產物的合成，高濃度的乙烯則會抑制次生代謝產物形成[24].本研究中，GO處理對紫花苜蓿株高和地上生物量具有顯著抑制作用，表明紫花苜蓿受到了GO的嚴重脅迫，這與Liu等[25]在水稻中的研究結果一致.因此推測紫花苜蓿中HRGP含量的降低可能是由GO對紫花苜蓿造成脅迫引起乙烯濃度不斷升高所致.

幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶在高等植物體內普遍存在，正常情況下在植物體內保持較低的濃度水平.幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶可通過多種誘導因子誘導產生，能夠破壞真菌細胞壁上的幾丁質和β-1，3-葡聚糖，直接殺死病原菌，被認為是植物誘導抗病的生理機制之一.Li等[26]用枯萎病菌誘導黃瓜時發現，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性越高黃瓜品種的抗病性越強.本研究中，GO處理降低了紫花苜蓿體內幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性，高濃度GO處理顯著抑制了幾丁質酶活性，表明GO脅迫嚴重破壞了紫花苜蓿自身防御系統.GO上的含氧基團能夠與酶分子發生靜電相互作用，在不使酶變性的情況下顯著抑制α-糜蛋白酶（ChT）活性[27].另外，GO可以改變辣根過氧化物酶的結構，從而引起酶活性、動力學常數和酶效率的降低[28].以上研究結果均是通過體外酶活測試所得，而本研究中GO處理使得紫花苜蓿體內2種抗病酶活性降低，GO可能通過植物胞壁進入細胞，引起幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶失活，從而導致酶活性的降低，但有關GO在體內降低酶活性的作用機理尚不明確，有待進一步研究.

綜上所述，GO添加到土壤中能夠抑制紫花苜蓿的生長，降低其體內PAL、幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，對植物防御系統造成負面影響，且隨著添加量的增加抑制作用增強.GO顯著降低了紫花苜蓿細胞壁HRGP含量，0.4%GO和0.6%GO顯著降低了木質素含量，破壞了植物抵御病原菌的屏障.因此，在GO應用過程中，應該注意其可能使植物抗病能力降低的風險.另外，基于本研究所得結果，在進一步的研究中應進行紫花苜蓿病原菌侵染實驗，探究GO在紫花苜蓿抵御病原菌侵染過程中對其抗病性及生理機制的影響.