體外模擬消化對酸棗仁蛋白酶解產物抗氧化活性的影響

韓榮欣

張紅印1

周光鑫1

王海東1

肖鳳琴1

李光哲1,2

嚴銘銘1,2

(1. 長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2. 吉林省中藥保健食品科技創新中心，吉林 長春 130117)

酸棗仁作為國家頒布的首批藥食同源中藥材，近年來在食品及保健食品中的應用日益增加。現代科學研究表明，酸棗仁中富含多種化學成分，如皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸以及蛋白質等化學成分[1]，具有多種藥理作用，如鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等對中樞神經系統作用，抗動脈粥樣硬化、抗心律失常等對心血管系統作用，以及抗氧化、抗腫瘤、抗炎、改善記憶能力等其他藥理作用[2]。研究[3]表明，酸棗仁中蛋白質含量約占其干重的40%，含有17種人體所需氨基酸，其組成較為合理，具有較高的營養價值和研究前景。

自由基是人體在進行正常生命活動時產生的中間代謝產物。目前已從多種植物(如黑豆[4]、綠豆[5]、核桃[6]等)中提取分離出蛋白質酶解產物及肽類物質，并且表現出較好的自由基清除活性，這些蛋白酶解產物或抗氧化肽可作為食品添加劑有效地應用于食品加工行業。

課題組[7]前期研究發現，酸棗仁蛋白具有一定的抗氧化活性，且其功能特性較好，可作為一種潛在的新型功能性蛋白資源應用于食品行業中。采用酶解法對酸棗仁蛋白進行酶解處理得到的酸棗仁蛋白酶解產物，具有比酸棗仁蛋白更好的功能特性[8]以及體外抗氧化活性。研究擬通過體外模擬胃腸消化，對消化前后酸棗仁蛋白酶解產物的氨基酸組成以及體外抗氧化活性進行比較，探究人體攝入后對酸棗仁蛋白酶解產物的活性變化，為酸棗仁蛋白及其酶解產物在食品和保健食品行業的應用提供依據。

1 試劑與儀器

1.1 試驗材料

酸棗仁蛋白：課題組自制；

堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶：上海源葉生物科技有限公司；

人工胃液：北京百奧萊博科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+)：北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗儀器

高速中藥粉碎機：HX-400A型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市佳美儀器有限公司；

集熱式磁力攪拌器：DF-101S型，金壇市醫療器械廠；

冷凍干燥機：SCIENTZ-50F型，寧波新芝凍干設備股份有限公司；

紫外分光光度計：UV-1700型，日本島津(中國)有限公司；

高效液相色譜儀：2010A型，日本島津(中國)有限公司；

臺式pH計：S220-K-CN型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

電子分析天平：AB265-S型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

高速離心機：Centrifuge 5840 R型，德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸棗仁蛋白酶解產物制備 根據Wang等[9]的方法并修改。取酸棗仁蛋白，加入蒸餾水配制成質量分數為5%的蛋白溶液，m酶∶m底物為1∶50，加入堿性蛋白酶，調節溶液pH為8.5，酶解時間3 h，90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻后用1.0 mol/L的NaOH調節溶液pH至7.0，8 000 r/min離心10 min，取上清液，凍干得酸棗仁蛋白酶解產物(SZPHs)。

1.3.2 體外模擬胃腸消化 根據Zhang等[10]的方法并修改。取酸棗仁蛋白酶解產物，加入蒸餾水配制成質量分數為1%的溶液，與模擬人工胃液按V酸棗仁蛋白酶解產物∶V模擬人工胃液為1∶1混勻，用濃度為1 mol/L的HCl調節溶液pH至3.0，向混合溶液中加入胃蛋白酶，使其用量為2 000 U/mL，37 ℃、100 r/min振蕩2 h，冷卻后用1.0 mol/L 的NaOH調節溶液pH至7.5，將消化液與模擬腸液按V消化液∶V模擬腸液為1∶1混勻，加入胰蛋白酶，使其用量為100 U/mL，繼續消化2 h，100 ℃水浴滅酶10 min，冷卻后用1.0 mol/L的NaOH調節溶液pH至7.0，8 000 r/min離心10 min，取上清液凍干得酸棗仁蛋白酶解產物消化物(SZPHs-GD)。

1.3.3 氨基酸組成分析 根據Wang等[9]的方法并修改。取SZPHs、SZPHs-GD各30 mg，加入4 mL濃度為6 mol/L 的HCl溶液，110 ℃反應24 h。由于測定方法為酸水解法，色氨酸在測定過程中大部分被破壞，導致其含量較低，故不作分析。

1.3.4 分子量分布測定 參照Zhang等[10]的方法。色譜條件：色譜柱為Shodex OHpak SB-803 HQ GPC色譜柱；流動相為乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=20.0∶80.0∶0.2)；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長220 nm；進樣量20 μL。根據標準品校準曲線計算各樣品分子量分布范圍：核糖核酸酶A(13.700 kDa)、人胰島素(5.808 kDa)、胸腺肽α1(3.108 kDa)、生長抑素(1.638 kDa)、甘氨酸—甘氨酸—甘氨酸(0.189 kDa)。

1.3.5 體外抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力：根據Wen等[11]的方法并修改。取一定質量的SZPHs及SZPHs-GD，加蒸餾水配制成不同質量濃度的溶液；準確稱取4.00 mg DPPH粉末，加95%乙醇超聲溶解定容至100 mL，制備0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別吸取1 mL樣品溶液與DPPH溶液混勻，室溫下避光反應30 min，測定517 nm處吸光度；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組，以0.5 mL蒸餾水+0.5 mL 95%乙醇混合溶液代替DPPH溶液作為樣品對照組，以維生素C為陽性對照組，并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

S——DPPH自由基/超氧陰離子清除率，%；

A0——空白對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值；

A2——樣品對照組吸光值。

(2) ABTS+自由基清除能力：根據Chang等[12]的方法并修改。將5 mL濃度為7.4 mmol/L的ABTS+儲備液與88 μL濃度為2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻，靜置12～16 h，配制成ABTS+儲備液。取ABTS+儲備液0.4 mL，用pH為7.4的PBS溶液稀釋，使734 nm處吸光度為0.7±0.2，制成ABTS+工作液。分別將200 μL ABTS+工作液與10 μL不同濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應6 min，測定734 nm處吸光度值。用10 μL PBS溶液代替樣品溶液作為對照組，以維生素C為陽性對照組，按式(2)計算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

S——ABTS+自由基清除率，%；

A0——空白對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值。

(3) 超氧陰離子清除能力：采用鄰苯三酚自氧化法[13]。取pH為8.2的Tris-HC1溶液3 mL，加入不同質量濃度的樣品溶液0.1 mL，(25.0±0.5) ℃水浴20 min，加入25 ℃預熱后的鄰苯三酚溶液(7 mmol/L)0.3 mL，混勻，25 ℃水浴4 min，迅速加入濃鹽酸1 mL，混勻，測定420 nm處吸光度值；以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對照組，以3 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為樣品對照組，以維生素C為陽性對照組，按式(1)計算超氧陰離子清除率。

(4) 羥基自由基清除能力：采用鄰二氮菲法[14]。取鄰二氮菲溶液(0.75 mmol/L)1 mL于試管中，加入PBS溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)2 mL，再加入樣品溶液1 mL，混勻，加入FeSO4溶液(0.75 mmol/L)1 mL，混勻，加入0.025% H2O2溶液1 mL，混勻，37 ℃水浴1 h，測定536 nm處吸光度值；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對照組，以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品對照組，以維生素C為陽性對照組，按式(3)計算羥基自由基清除率。

(3)

式中：

S——羥基自由基清除率，%；

A0——空白對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值；

A2——樣品對照組吸光值。

1.3.6 數據分析 所有試驗平行測定3次，結果取平均值，使用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 體外模擬消化前后的氨基酸組成變化

由表1可知，酸棗仁蛋白酶解產物及其消化物中谷氨酸(分別為17.66%，19.07%)、天冬氨酸(分別為7.92%，8.62%)、精氨酸(分別為6.84%，6.87%)質量分數較高，其中天冬氨酸、谷氨酸等帶負電氨基酸(NCAA)為主要氨基酸，質量分數分別為25.58%和27.69%，這是由于NCAA是種子類植物中主要的氨基酸[15]。研究[16]表明，NCAA可通過提供電子達到有效清除自由基的作用。SZPHs及SZPHs-GD中還具有一定的疏水性氨基酸(HAA，分別為16.13%，14.82%)，HAA的存在與其脂溶性有關，可通過與脂溶性自由基結合達到清除自由基的作用[17]。此外，SZPHs及SZPHs-GD中必需氨基酸(EAA)含量較高，且消化前后質量分數無顯著變化，分別為17.34%和17.14%，各氨基酸含量均達到WHO/FAO對成人需求量的要求，表明SZPHs具有一定營養價值。體外模擬消化試驗表明，SZPHs經體外模擬胃腸消化后，HAA含量有所降低，而親水性氨基酸、芳香族氨基酸(AAA)及NCAA含量增加，這種含量變化現象可能會對其體外抗氧化活性造成一定影響。

表1 SZPHs及SZPHs-GD的氨基酸組成?

2.2 體外模擬消化前后分子量分布變化

由表2可知，SZPHs及SZPHs-GD分子量主要在5 kDa以下，分別占其總比例的82.06%及86.79%。SZPHs經體外模擬消化后，分子量>10 kDa的比例有所降低，分子量<5 kDa的比例有所增加，表明SZPHs經體外模擬消化后，其肽鍵被進一步破壞，產生了更多分子量較小的肽段。此外，分子量<1 kDa的肽因其較低的分子量而表現出更強的抗氧化活性[18]。SZPHs及SZPHs-GD所含<1 kDa的肽段分別占總比例的17.79%和19.67%，說明SZPHs及SZPHs-GD具有較好的抗氧化活性。

2.3 體外模擬消化前后的抗氧化活性變化

2.3.1 DPPH自由基清除活性 由圖1可知，當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD的DPPH自由基清除活性與樣品濃度呈劑量依賴關系，且在質量濃度為2.5 mg/mL時，二者均達到其最大清除率(93.99%和81.25%)。說明SZPHs經模擬胃腸消化后，在1.0～2.5 mg/mL質量濃度范圍內，DPPH自由基清除率可達到72.89%～81.25%，具有較高的DPPH自由基清除活性，優于小麥蛋白酶解產物[19](55.29%)、苦蕎蛋白酶解產物[18](71.91%)、蛋清多肽[20](69.20%)等。此外，經體外模擬胃腸消化后，當質量濃度為0.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率由73.79%降至55.45%，可能是由于消化后HAA含量降低，其與脂溶性的DPPH結合能力降低，故DPPH自由基清除能力有所降低，與馬勇等[21]的結果類似。

2.3.2 ABTS+自由基清除活性 由圖2可知，當質量濃

表2 SZPHs及SZPHs-GD的分子量分布

度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD對ABTS+自由基清除活性隨質量濃度的增加而增強，且在質量濃度為2.5 mg/mL時，二者均達到最大清除活性(86.59%和90.40%)。當質量濃度為1.0～2.5 mg/mL時，SZPHs-GD對ABTS+自由基的清除率可達到78.83%～90.40%，具有較好的ABTS+自由基清除活性，優于其他蛋白酶解產物或多肽(大豆蛋白酶解物55.84%[22]，芝麻抗氧化肽51.26%[23]等)。SZPHs經體外模擬胃腸消化后，所得產物SZPHs-GD對ABTS+自由基的清除能力增強，可能是由于SZPHs經模擬胃腸消化后，親水性的肽和氨基酸含量增加，進而增強了對ABTS+自由基的清除能力。綜上，SZPHs經體外模擬消化后，可進一步提升對ABTS+自由基的清除活性。

2.3.3 超氧陰離子清除活性 由圖3可知，當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD對超氧陰離子的清除活性與樣品濃度呈正相關，二者均在2.5 mg/mL時具有最高的清除活性(43.19%和47.51%)。當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs-GD對超氧陰離子的清除率可達到30.46%～47.51%，具有較好的超氧陰離子清除活性。此外，SZPHs-GD的超氧陰離子清除活性較SZPHs略有提高，其中最高可提高近10%，可能是由于模擬胃腸消化后，芳香族氨基酸含量增加，其提供質子能力增強，提高了對超氧陰離子的清除能力[13]。綜上，SZPHs經體外模擬消化后，可進一步提高其對超氧陰離子的清除活性。

圖1 SZPHs及SZPHs-GD的DPPH自由基清除率

圖2 SZPHs及SZPHs-GD的ABTS+自由基清除率

圖3 SZPHs及SZPHs-GD的超氧陰離子清除率

2.3.4 羥基自由基清除活性 由圖4可知，當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD對羥基自由基的清除活性隨質量濃度的增加逐漸增強，且在2.5 mg/mL時達到最大值(50.23%和32.66%)。當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs-GD對羥基自由基清除率可達9.92%～32.66%，具有一定的羥基自由基清除活性。經過體外模擬消化后，SZPHs-GD對羥基自由基的清除活性略有降低，可能是由于消化后產生了對羥基自由基沒有清除作用的小肽或者氨基酸，與Barbara等[24]的結果類似。

3 結論

經體外模擬胃腸消化后，酸棗仁蛋白酶解產物消化物中疏水性氨基酸含量有所降低，而帶負電氨基酸和親水性氨基酸含量升高，必需氨基酸含量無明顯變化，可達到WHO/FAO所要求的成人需求量，說明模擬胃腸消化對酸棗仁蛋白酶解產物營養價值影響較小。分子量分布研究表明，酸棗仁蛋白酶解產物經體外模擬消化后，分子量>5 kDa的比例增加，表明模擬胃腸消化后，可進一步降低其分子量。體外抗氧化試驗表明，酸棗仁蛋白酶解產物消化物對DPPH自由基清除率最高可達81.25%，對ABTS+自由基清除率最高可達90.40%，對超氧陰離子清除率最高可達47.51%，對羥基自由基清除率最高可達32.66%，具有較好的體外抗氧化活性。綜上，酸棗仁蛋白酶解產物經模擬胃腸消化后，所得產物酸棗仁蛋白酶解產物消化物仍具有較好的氨基酸組成及良好的抗氧化活性，可作為一種潛在的抗氧化劑應用至食品行業中。后續將對酸棗仁蛋白酶解產物及酸棗仁蛋白酶解產物消化物在細胞試驗中的抗氧化作用進行研究，并通過凝膠色譜等技術對酸棗仁蛋白酶解產物及酸棗仁蛋白酶解產物消化物進行分離純化，以期得到具有高抗氧化活性的肽段。

圖4 SZPHs及SZPHs-GD的羥基自由基清除率