青海亞麻籽中木脂素含量測定及抗氧化活性分析

陳昀昀

王進英1,2

王興瑞1

韓玉澤1

李應霞1

王淑珍1

(1. 青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2. 青海大學三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

亞麻籽是木脂素最豐富的天然谷物來源，是其他谷物資源的75～800倍[1]。開環異落葉松酚葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)是亞麻籽中主要的木脂素，一部分以游離形式存在，一部分與3-羥基-3-甲基-戊二酸通過酯鍵結合形成低聚體；其他酚類化合物如對香豆酸、阿魏酸與糖基以糖苷鍵結合的方式存在于低聚體中[2]。通過堿水解和酸水解使酯鍵與糖苷鍵斷裂，可生成SDG、對香豆酸糖苷、開環異落葉松脂素(secoisolariciresinol，SECO) 等[3-4]。亞麻木脂素對癌癥、糖尿病和心血管疾病具有化學預防作用，其藥理活性被認為是因其具有高的抗氧化能力和植物雌激素活性[5-8]。

目前，關于亞麻籽的研究主要集中在對其營養品質評價、活性物質提取與含量分析、保健食品開發等方面，而關于青海地區亞麻研究主要集中在育種的發展，對于亞麻籽中木脂素含量與抗氧化活性的差異性研究尚未見報道。試驗擬采用反相高效液相色譜法定量測定青海9個產地、20種亞麻籽中木脂素含量及其抗氧化能力，為促進青海地區亞麻籽及其加工副產物的高值化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種亞麻籽：詳見表1。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海晶純生化科技股份有限公司；

2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：北京索萊寶科技有限公司；

亞麻木脂素(SDG、SECO)標準品：四川德斯特生物公司；

氫氧化鈉、磷酸、鹽酸：分析純，天津市河東區紅巖試劑廠；

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗機：SB-3200TDT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

循環水真空泵：SHZ-III型，上海亞榮生化儀器廠；

分析天平：DSH-50-5型，上海越平科學儀器有限公司；

液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

表1 20種亞麻籽樣品信息

紫外分光光度計：UV-2600型，日本島津公司；

脂肪測定儀：SOX406型，山東海能科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂亞麻籽粉的制備 亞麻籽清理、分揀、粉碎后得到亞麻籽粉，利用索氏抽提法脫脂，熱風干燥得脫脂亞麻籽粉。

1.3.2 亞麻木脂素的提取 根據文獻[9-10]并修改：稱量每種脫脂亞麻籽粉4 g，提取溶劑為60%乙醇，固液比(m脫脂亞麻籽粉∶V乙醇)1∶15 (g/mL)，超聲功率400 W，超聲時間15 min，抽濾，離心，上清液減壓濃縮后得SDG聚合物提取液。用0.2 mol/L的NaOH 溶液將提取液pH值調至11，50 ℃水浴2 h，用1 mol/L鹽酸調節中和，低溫濃縮后得SDG提取液，經0.45 mm醋酸纖維膜過濾，待HPLC測定。

精確量取5 mL SDG溶液，用1 mol/L鹽酸調pH值至2.5，90 ℃水浴酸解3 h，得SECO提取液，經0.45 mm醋酸纖維膜過濾，待HPLC測定。

1.3.3 亞麻木脂素標準品標準曲線的制備 準確將亞麻木脂素SDG和SECO標準品配制成一定濃度范圍的標準液。在已確定的液相色譜條件下進行上樣檢測，將標準物質質量濃度X與峰面積Y進行線性回歸，得標準曲線(見表2)。根據色譜保留時間與峰面積進行定量，結果以干基表示(mg/g)。

1.3.4 液相色譜法測定亞麻木脂素含量 液相色譜條件見表3，以亞麻木脂素標準品的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性擬合得回歸方程，并按式(1)計算亞麻籽木脂素含量。

(1)

式中：

M——亞麻木脂素含量，mg/g；

C——提取液中木脂素的質量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數；

W——脫脂亞麻籽粉末的質量，g。

1.3.5 亞麻木脂素抗氧化活性測定 參照文獻[11-13]并稍作修改。

(1) DPPH自由基清除能力：用體積分數為60%的乙醇將樣品液稀釋50倍，充分振搖均勻，與0.2 mmol/L的DPPH溶液按V樣品液∶VDPPH液=1∶1混合，室溫避光靜置30 min，測定517 nm處吸光值，按式(2)計算DPPH自由基清除率。

表2 SDG和SECO的峰面積回歸分析

表3 亞麻木脂素液相色譜條件

(2)

式中：

C——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光值；

A1——樣品組吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力：7.40 mmol/L ABTS溶液與2.60 mmol/L過硫酸鉀溶液按VABTS溶液∶V過硫酸鉀溶液=1∶1 混勻，室溫避光靜置12 h，使用前用無水乙醇稀釋，使吸光度在734 nm處為 0.70±0.02，得ABTS工作液。配制不同質量濃度樣液，分別取1.00 mL，加入ABTS工作液 3.00 mL，混勻，避光靜置10 min，測定734 nm處吸光度，并按式(2)計算ABTS自由基清除率。

1.4 數據處理分析

試驗數據平行測定3次，結果取平均值。運用SPSS 26.0軟件進行數據統計分析，相關性分析采用Pearson雙側檢驗法，顯著性差異采用LSD多重比較法。Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種亞麻籽木脂素含量分析

由表4可知，SDG含量為7.53～23.33 mg/g，SECO含量為0.85～2.55 mg/g。不同品種亞麻籽木脂素含量之間具有顯著性差異(P<0.05) 。

亞麻籽木脂素經堿水解后主要得到SDG，不同品種間SDG含量差異較大，含量最高的品種產自于海北門源(QH-19)為(23.33±0.14) mg/g，含量最低的品種產自于西寧大通(QH-4)為7.53 mg/g。SDG含量≥20 mg/g的品種有5種，其余15個品種亞麻籽中的SDG含量為7～19 mg/g。亞麻籽木脂素經酸水解后主要得到SECO，海北門源(QH-19)亞麻籽中SECO含量最高為(2.55±0.12) mg/g，西寧湟源(QH-5)亞麻籽中SECO含量最低為(0.85±0.22) mg/g。SECO含量≥2 mg/g的品種有5種，其余15個品種亞麻籽中的SECO含量為0.89～1.99 mg/g。此外，亞麻籽中SDG和SECO(r=0.986，P<0.01)含量具有顯著相關性，表明SDG含量高的亞麻籽品種，SECO含量也相對較高。這可能與亞麻籽中木脂素的存在形式及穩定性有關。亞麻籽中的SECO與糖苷結合，以開環異落葉松酚葡萄糖苷(SDG)形式存在。SDG聚合物堿水解會游離出SDG，通過酶水解或酸水解使SDG糖苷鍵斷裂，釋放出SECO[2]。這也可能是受收獲成熟度的影響。因為亞麻籽成熟過程伴隨著催化木酚素合成酶的表達和活性的改變[14-16]。綜上，海北門源(QH-19)亞麻籽中兩種木脂素含量最高。

2.2 不同產地亞麻籽木脂素含量分析

由圖1可知，青海不同產地亞麻籽樣品中的木脂素含量均具有顯著性差異(P<0.05)。海北門源、海東樂都、西寧湟中、海東民和及海東互助的亞麻籽樣品中的2種木脂素含量均顯著高于海東平安、海東循化、西寧湟源和西寧大通的。

不同產地的亞麻籽中SDG含量差異較大。西寧湟中亞麻籽中的SDG平均含量為(16.95±5.09) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品種有2個；海東互助亞麻籽中的SDG平均含量為(15.77±3.38) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品種有3個；海東民和亞麻籽中的SDG平均含量為(16.86±4.95) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g 的品種有2個；海東平安亞麻籽中的SDG平均含量為(14.62±3.20) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品種有2個；海北門源亞麻籽中的SDG含量最高，為(23.33±0.14) mg/g，西寧大通的最低，為7.53 mg/g。

不同產地的亞麻籽中SECO含量差異性顯著(P<0.05)。西寧湟中亞麻籽中的SECO平均含量為(1.83±0.58) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有2個；海東互助亞麻籽中的SECO平均含量為(1.73±0.38) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有3個；海東民和亞麻籽中的SECO平均含量為 (1.74±0.69) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有2個；海東平安亞麻籽中的SECO平均含量為(1.58±0.35) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有2個；海北門源亞麻籽中SECO含量最高為(2.55±0.12) mg/g，西寧湟源的最低，為(0.85±0.22) mg/g。

表4 青海不同品種亞麻籽中木脂素含量?

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

綜上，青海省9個不同產地中海北門源、海東樂都、西寧湟中以及海東民和亞麻籽樣品中的木脂素含量顯著優于其他5個產地，其含量趨勢是海拔越高、緯度越高、氣候越冷涼，亞麻籽中木脂素含量越高，與胡嘵軍等[17]的結論基本一致。

2.3 亞麻籽中木脂素抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更加穩定[18]，因此DPPH自由基清除能力常被用作評價抗氧化能力的一種方法。由表5可知，20種亞麻籽中兩種木脂素均具有較強的抗氧化能力，且不同樣品間差異顯著(P<0.05)。SDG和SECO對DPPH 自由基的清除率分別為53.18%～62.97%，52.87%～61.86%。其中，海北門源(QH-19)亞麻籽樣品的抗氧化能力較強，SDG和SECO的DPPH自由基清除率分別為62.97%，61.86%；西寧大通(QH-4)亞麻籽樣品的抗氧化能力最低，SDG和SECO的DPPH自由基清除率分別為53.18%，52.87%。

從青海省不同產地來看，海北門源、海東樂都、海東平安、西寧湟中亞麻籽樣品中SDG的DPPH自由基清除率較強，分別為62.97%，59.34%，58.50%，58.50%；SECO的DPPH自由基清除率較強的產地分別是海北門源、海東樂都、海東民和、西寧湟中，分別為61.86%，60.32%，56.89%，56.73%。綜上，海北門源、海東樂都、海東平安、海東民和以及西寧湟中的亞麻籽木脂素的抗氧化活性優于其他產地的。不同產地及同一產地間亞麻木脂素抗氧化能力存在差異，與臧茜茜等[8]的研究結果一致。亞麻木脂素含量及抗氧化活性會受品種、生長環境、氣候條件、貯藏時間等因素的影響，因此木脂素含量及抗氧化活性存在不同程度的差異[1,19-20]，而且不同品種的同一物種間，營養成分含量也不同[21]。

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由表6可知，青海20種亞麻籽中兩種木脂素均具有較強的抗氧化能力，且不同樣品間差異顯著(P<0.05)。SDG和SECO對ABTS自由基的清除能力分別為52.98%～62.59%，51.08%～61.99%。其中，海北門源(QH-19)亞麻籽樣品的抗氧化能力較強，SDG和SECO的ABTS自由基清除率分別為62.59%，61.99 %；西寧大通(QH-4)亞麻籽樣品的抗氧化能力最低，SDG和SECO的ABTS自由基清除率分別為52.98%，51.08%。

表5 DPPH自由基清除能力?

從青海省不同產地來看，海北門源、海東樂都、海東民和、海東平安亞麻籽樣品中SDG的ABTS自由基清除率較強，分別為62.59%，62.33%，60.19%，58.92%。SECO的ABTS自由基清除率較強的產地分別是海北門源、海東樂都、西寧湟中、海東民和，分別為61.99%，60.59%，60.23%，60.01%。綜上，海北門源、海東樂都、西寧湟中、海東民和的亞麻籽木脂素的抗氧化活性優于其他5個產地的，可能是由于亞麻籽中木脂素含量不同。

3 結論

青海省9個產地的亞麻籽中木脂素含量及抗氧化能力差異性顯著(P<0.05)，其中海北門源(QH-19)的亞麻籽木脂素含量最高，西寧大通(QH-4)的最低，前者的木脂素含量是后者的約3倍。海東民和、海東互助、海東樂都的亞麻籽中木脂素含量高于西寧大通及西寧湟源的。青海省亞麻籽中木脂素也具有較強的抗氧化能力，其中，海北門源(QH-19)亞麻籽樣品的抗氧化活性最強。9個產地中海東樂都、海東平安、海東民和及西寧湟中的亞麻籽木脂素的抗氧化活性顯著高于其他5個產地的。后續可進一步擴大青海省不同產地和品種樣本量，并對木脂素的活性進行更深入探究，從而為青海亞麻籽深加工和綜合利用提供理論支持。

表6 ABTS自由基清除能力?