卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠急性肺損傷的作用及機制

王嬌，張秀瓏，王佳興，付鶴鵬，張玉想*

1河北北方學院研究生學院，河北張家口 075000；2河北北方學院附屬第一醫院呼吸內科，河北張家口 075000；3解放軍總醫院第八醫學中心重癥醫學科，北京 100091；4河北省滄州市中西醫結合醫院重癥醫學科，河北滄州 061001

膿毒癥的病理生理特征是感染引起宿主體內失控性的炎癥反應，可導致機體內組織及器官功能損傷，嚴重者可進展為多臟器衰竭(multiple organ failure，MOF)[1]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是膿毒癥的主要并發癥[2]，但目前膿毒癥肺損傷的機制及治療方法尚不十分明確[3]。自噬是由溶酶體介導的對老化細胞器、病原體的吞噬降解過程，是一種重要的防御保護機制，在細胞老化、代謝、免疫、感染等方面起著重要作用[4-5]。研究發現，膿毒癥大鼠肺組織自噬水平升高，而上調自噬可以減輕膿毒癥大鼠的肺損傷[6-8]。盡管近年來膿毒癥的治療已經取得了長足的進步[9]，但膿毒癥仍然是危重患者死亡的重要原因。卡絡磺鈉是一種腎上腺素縮氨脲與磺酸鈉的復合物，主要通過提高毛細血管壁的彈性而降低血管通透性，增強血管損傷部位的回縮能力，從而減輕出血或止血[10]。本研究觀察卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺形態學、影像學、血氧交換功能、血管通透性改變及自噬水平的影響，并初步探討其作用機制，以期為膿毒癥肺損傷的救治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級雄性Wistar大鼠145只，體重220～240 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。注射用卡絡磺鈉(20 mg/支，武漢華龍生物制藥有限公司)，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)及伊文氏藍(美國Sigma公司)，Micro-CT(德國西門子公司，中國醫學科學院動物所影像平臺提供)，GEM PREMIER 4000血氣分析儀(美國Werfen公司)，兔抗大鼠LC3B的多克隆抗體(美國CST公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Nikon & Spot圖像采集處理系統(日本Nikon公司)，凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥大鼠模型制備及實驗分組 選取125只大鼠，采用隨機數字表法分為假手術組、膿毒癥組、卡絡磺鈉低劑量(8 mg/kg)組、卡絡磺鈉中劑量(40 mg/kg)組、卡絡磺鈉高劑量(80 mg/kg)組，每組25只。按照文獻[11]中的方法對大鼠行盲腸結扎穿孔，構建嚴重腹腔感染致膿毒癥模型：動物術前稱重、編號，禁食12 h，自由飲水。用3%戊巴比妥40 mg/kg行腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后固定，沿腹中線做一長約1.5 cm的切口，逐層切開，暴露直腸并小心游離其盲腸盲端，在距盲端1 cm處結扎，用18號針頭貫穿2次，擠出少量腸內容物，并留置一條2 mm寬的橡皮條貫通盲腸，防止針孔閉合。然后將盲腸小心移入腹腔，逐層縫合腹壁切口。術后動物可自由活動及飲水。假手術組只開腹翻動腸管后關腹，不結扎及穿孔盲腸。卡絡磺鈉低、中、高劑量組分別在術后0.5 h、8 h及16 h于大鼠腹腔內注射不同劑量(8、40、80 mg/kg)的卡絡磺鈉。假手術組與膿毒癥組大鼠于同時間點腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠術后生存率觀察 每組隨機選取15只大鼠，分別于術后6、12、24、36、48、72 h觀察其生存情況，計算生存率。

1.2.3 大鼠動脈血氣測定 每組隨機選取10只大鼠用于檢測卡絡磺鈉對膿毒癥肺損傷肺形態學及功能的影響。術后24 h，假手術組及膿毒癥組、卡絡磺鈉低、中、高劑量組各存活10、6、7、9、8只大鼠，麻醉后用肝素抗凝的1 ml動脈血氣針經腹主動脈采血0.5 ml，采用PREMIER 4000動脈血血氣分析儀測定氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)，計算氧合指數。

1.2.4 大鼠肺部Micro-CT檢測 術后24 h麻醉大鼠，采用Micro-CT觀察大鼠肺部影像學特點。測量參數：攝片時間120 s，電壓90 kV，電流160 μA，照片像素40 μm，重建后圖片像素大小1024×1024。

1.2.5 大鼠肺系數檢測 采用頸部脫臼法將各組存活大鼠處死，取大鼠雙側肺，吸干表面水分，計算肺系數。肺系數(LW/BW)=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.2.6 大鼠肺組織病理學觀察及評分 剪取各組大鼠右肺下葉組織小塊，浸入4%多聚甲醛溶液內固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋、切片(5 μm)，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。在光鏡下任意選取10個視野，參照Hong等[12]的標準進行肺組織病理損傷計分。DM4000B光學顯微鏡觀察病理學結果，進行病理學評分，評分項目包括肺泡腔充血、中性粒細胞浸潤、纖維蛋白滲出、肺泡間隔增寬，每項按損傷程度評為0、1、2及3分，分別為無損傷、輕度損傷、中度及重度損傷，取其平均值。

1.2.7 大鼠肺組織通透性檢測 采用伊文氏藍(EB)染料滲出技術[13]檢測大鼠肺組織通透性。大鼠尾靜脈注射溶于生理鹽水的EB(2 ml/kg)，然后用PBS(10 ml)沖洗肺循環；取右下肺葉約0.2 g，浸泡在2 ml甲酰胺溶液(1 ml/100 mg)中，與甲酰胺在60 ℃條件下共孵化16 h，待肺組織中色素全部萃取后，取出組織，7000×g離心10 min，取上清液，測量吸光度(OD620)值，計算組織中的EB含量，以此表示肺血管通透性。

1.2.8 Western blotting測定大鼠肺組織LC3蛋白表達量 由于卡絡磺鈉中、高劑量組大鼠肺組織改變無明顯差異，因此只測定假手術組、膿毒癥組、卡絡磺鈉低劑量組、卡絡磺鈉中劑量組大鼠肺組織中LC3的表達。將100 μg大鼠肺組織裂解液進行SDS-PAGE電泳，電轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉。一抗為兔抗大鼠LC3多克隆抗體(1:800，美國CST公司)，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1:5000，北京中杉金橋生物技術有限公司)，增強化學發光法顯色。以GAPDH為內參照。以特異性LC3與對應GAPDH蛋白條帶光密度值的比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表示LC3蛋白的表達量。

1.2.9 3-MA對大鼠肺組織自噬水平的影響 為探討卡絡磺鈉干預機制與自噬的關系，另取大鼠20只，隨機分為自噬抑制劑組(3-MA組)與卡絡磺鈉中劑量(40 mg/kg)組，每組10只。卡絡磺鈉中劑量組分別于術后0.5 h、8 h及16 h腹腔內注射40 mg/kg卡絡磺鈉；3-MA組于術后即刻腹腔內注射15 mg/kg 3-MA，術后0.5 h、8 h及16 h予40 mg/kg卡絡磺鈉干預。按1.2.3、1.2.6和1.2.8中的方法檢測大鼠肺組織氧合功能、組織病理學改變及LC3蛋白的表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。數據符合正態分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用t檢驗。采用Kaplan-Meier法分析生存率。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠生存率的影響 各卡絡磺鈉組大鼠生存率均高于膿毒癥組，卡絡磺鈉中劑量及高劑量組大鼠生存率高于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)，卡絡磺鈉中劑量與高劑量組大鼠生存率差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠生存率比較(n=15)Fig.1 Comparison of survival rate of rats in each group (n=15)

2.2 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺氧合功能的影響膿毒癥組大鼠動脈血PO2及氧合指數低于假手術組，各卡絡磺鈉組大鼠動脈血PO2及氧合指數均高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.01)；各卡絡磺鈉組間大鼠動脈血PO2及氧合指數差異無統計學意義(P>0.05)。各組大鼠動脈血PCO2差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 各組大鼠動脈血PO2、PCO2及氧合指數比較 (mmHg,±s)Tab.1 Comparison of PO2, PCO2 and oxygenation index of rats in each group (mmHg, ±s)

表1 各組大鼠動脈血PO2、PCO2及氧合指數比較 (mmHg,±s)Tab.1 Comparison of PO2, PCO2 and oxygenation index of rats in each group (mmHg, ±s)

PO2. 氧分壓；PCO2. 二氧化碳分壓；與假手術組比較，(1)P<0.01；與膿毒癥組比較，(2)P<0.01。

組別 PO2PCO2氧合指數假手術組(n=10)118.5±21.7 31.3±8.7 564.3±103.2膿毒癥組(n=6)60.0±20.0(1) 38.3±11.5 285.7±95.2(1)卡絡磺鈉低劑量組(n=7) 77.13±22.0(2) 38.9±11.3 367.3±104.6(2)卡絡磺鈉中劑量組(n=9) 87.0±14.0(2) 33.4±8.5 414.4±66.9(2)卡絡磺鈉高劑量組(n=8) 85.9±16.3(2) 34.1±11.4 408.7±77.9(2)F 9.9800.7749.981 P<0.0010.549<0.001

2.3 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺影像學的影響Micro-CT結果顯示，膿毒癥大鼠雙肺見斑片狀滲出，嚴重者可發生肺不張及肺實變(圖2，黑色箭頭)。給予卡絡磺鈉干預后，大鼠雙肺斑片滲出明顯減少，未見明顯的肺不張及肺實變；且隨著藥物劑量的增加，大鼠肺部炎癥表現逐漸減輕(圖2)。

圖2 各組大鼠肺Micro-CT結果Fig.2 Micro-CT show of each group rats

2.4 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺水腫的影響 肉眼觀察見假手術組大鼠肺組織表面光滑、干燥，紅白相間；膿毒癥大鼠肺組織腫脹明顯，表面呈暗紅色，且液體滲出較多。與膿毒癥大鼠比較，卡絡磺鈉組大鼠肺組織腫脹減輕，表面逐漸恢復至紅白相間，且肺表面液體滲出逐漸減少(圖3)。肺系數結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組大鼠肺系數明顯增加，而卡絡磺鈉中、高劑量組大鼠的肺系數與膿毒癥組比較明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

圖3 各組大鼠肺組織標本肉眼觀Fig.3 Macroscopic view of lung tissue specimens of rats in each group

表2 各組大鼠肺組織的特征表現(±s)Tab.2 Appearance of lung tissue of rats in each group (±s)

表2 各組大鼠肺組織的特征表現(±s)Tab.2 Appearance of lung tissue of rats in each group (±s)

與假手術組比較，(1)P<0.0 5；與膿毒癥組比較，(2)P<0.05；與卡絡磺鈉低劑量組比較，(3)P<0.05。

EB含量(μg/g)假手術組 (n=10)3.2±0.42.5±1.416.3±3.1膿毒癥組 (n=6)4.4±0.4(1) 13.5±1.5(1) 40.7±2.7(1)卡絡磺鈉低劑量組(n=7) 4.1±0.5 10.9±2.2(2) 31.0±2.0(2)卡絡磺鈉中劑量組(n=9) 3.8±0.7(2) 5.8±1.7(2)(3) 24.5±2.3(2)(3)卡絡磺鈉高劑量組(n=8) 3.7±0.4(2) 5.0±2.6(2)(3) 22.4±2.8(2)(3)F 6.50443.180102.100 P 0.001<0.001<0.001組別肺系數(mg/g)病理學評分(分)

2.5 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織學的影響 HE染色結果顯示，假手術組大鼠肺泡壁光滑，肺泡腔無滲出且結構清晰完整。膿毒癥組大鼠肺泡腔內出現大量紅細胞、炎性細胞及血漿樣物質滲出，肺泡間隔及肺泡壁明顯增厚不均，部分肺泡腔塌陷。各卡絡磺鈉組大鼠肺部均呈一定程度的組織水腫、炎性浸潤，但嚴重程度均不及膿毒癥組；中、高劑量組大鼠肺組織的炎癥改變程度較低劑量組進一步減輕(圖4)。與假手術組比較，膿毒癥組大鼠肺病理學評分明顯升高，各卡絡磺鈉組大鼠肺病理學評分均低于膿毒癥組，且卡絡磺鈉中、高劑量組大鼠肺病理學評分低于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

圖4 各組大鼠肺組織病理學表現Fig.4 Pathological appearance of lung tissues of rats in each group

2.6 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺血管通透性的影響

與假手術組比較，膿毒癥大鼠肺血管通透性增加，各卡絡磺鈉組大鼠的肺血管通透性均低于膿毒癥組，且卡絡磺鈉中、高劑量組大鼠肺組織的通透性低于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

2.7 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織自噬水平的影響 與假手術組比較，膿毒癥組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高(5.1±2.7vs. 2.7±0.7)，卡絡磺鈉低、中劑量組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于膿毒癥組(6.8±2.6、8.9±1.4vs. 5.1±2.7)，差異有統計學意義(P<0.05，圖5)。

圖5 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織自噬水平的影響Fig.5 The effect of carbazochrome sodium sulfonate on the autophagy level of lung tissue in septic rats

2.8 3-MA對卡絡磺鈉中劑量組大鼠肺組織氧合功能、病理學改變及自噬水平的影響 與卡絡磺鈉中劑量組比較，3-MA組大鼠肺組織病理損傷加重(圖6A)，氧合指數下降[(292.3±82.1) mmHgvs.(451.9±104.0) mmHg]，差異有統計學意義(P<0.05，圖6B)。與卡絡磺鈉中劑量組比較，3-MA組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(3.1±1.7vs.8.7±1.6)，差異有統計學意義(P<0.05，圖6C、D)。

圖6 3-MA對卡絡磺鈉中劑量組大鼠肺組織氧合功能、病理學改變及自噬水平的影響Fig.6 そe effect of 3-MA on the oxygenation function, histology and autophagy level of rat lung tissue in the middle dose carbazochrome sodium sulfonate group

3 討 論

卡絡磺鈉是一種毛細血管穩定劑，已被廣泛用于治療因毛細血管脆弱性引發的出血，也可用于治療牙周、關節腔、膀胱、前列腺等組織器官的血管高通透性，從而達到保護組織器官功能的作用[14-17]。有研究發現，卡絡磺鈉可以抑制肺血管通透性的增加，減輕由碘克沙酸誘導的動脈血PO2降低[18]。本研究發現，卡絡磺鈉可提高膿毒癥大鼠的生存率，對膿毒癥肺損傷具有保護作用，且具有劑量依賴性。本研究還發現，卡絡磺鈉能明顯降低大鼠肺組織EB含量，使動脈血PO2及氧合指數明顯提升，肺系數降低，提示卡絡磺鈉干預可降低膿毒癥引起的肺血管通透性增加，減輕組織液滲漏，降低肺水含量，改善肺氧合功能，與上述研究結果一致。進一步研究發現，與膿毒癥組比較，卡絡磺鈉組大鼠肺影像學及病理組織學結果顯示炎癥浸潤減少，血漿樣滲出減輕，病理評分明顯降低，且中劑量組的效果明顯優于低劑量組，證實應用卡絡磺鈉治療能減輕膿毒癥大鼠的肺損傷，并改善膿毒癥大鼠ALI的特征性改變。

自噬是將體內受損的細胞器或蛋白分子通過溶酶體進行自我吞噬及自我降解的過程。細胞可以通過自噬降解不需要的自身成分，循環利用氨基酸及其他可以被重新利用的物質，且有利于維持細胞的穩定[19]。自噬的改變與肺部疾病相關，尤其在慢性阻塞性肺疾病、肺動脈高壓、肺纖維化、炎癥性肺損傷、ARDS及結核的發生發展中起重要作用，可能成為相關疾病的干預靶點[20-22]。以往多項研究發現自噬參與了膿毒癥肺損傷的內源性保護機制[6-8,23]。本實驗通過測定LC3的蛋白表達量即LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值來反映自噬程度。LC3是哺乳動物細胞中酵母自噬相關基因8(autophagy-related gene 8，ATG8)的同源物，定位于前自噬泡及自噬泡膜表面，是參與自噬體形成的重要基因。自噬未啟動時，LC3以可溶性的LC3-Ⅰ形態常規表達于細胞表面；當自噬發生時，脂質衍生物磷脂酰乙醇胺與LC3-Ⅰ結合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是反映自噬水平的重要分子標志物，與自噬泡數量呈正比[21]。本研究通過Western blotting檢測了膿毒癥急性肺損傷時自噬標志蛋白LC3的表達情況以及卡絡磺鈉干預對其的影響，結果發現膿毒癥肺損傷大鼠肺組織中LC3-Ⅱ表達增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯高于假手術組，提示膿毒癥急性肺損傷時自噬水平增加；卡絡磺鈉干預使肺組織的自噬水平增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較膿毒癥組增加，且具有一定的劑量依賴性，中劑量組的效果優于低劑量組，表明卡絡磺鈉可上調大鼠肺組織的自噬水平。本研究結果還顯示3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著低于卡絡磺鈉中劑量組，且3-MA組大鼠肺通透性及組織學改變明顯加重，提示卡絡磺鈉的肺保護作用可被自噬抑制劑3-MA減弱。

綜上所述，本研究結果表明，卡絡磺鈉可能通過減輕血管滲漏、上調肺組織的自噬水平而對膿毒癥的ALI產生保護作用，且該保護作用具有一定的劑量依賴性。卡絡磺鈉上調肺組織自噬水平的機制尚不清楚，未來仍需要進一步探討卡絡磺鈉的作用機制，并進行臨床試驗，以期為臨床防治膿毒癥肺損傷提供理論依據。