外源MeJA 對紫花地丁生長及其生理生化的影響

李巧峽，潘朝朝，黃小霞，李紀綱，張正蓉，王 勃

（西北師范大學生命科學學院, 甘肅 蘭州 730070）

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是一種茉莉酸(jasmonic acid，JA)類似物，作為一種重要的天然植物生長調節劑，其廣泛地存在于植物體中，在植物生長發育以及抗脅迫中發揮著重要的作用[1]，目前，已有大量研究證實，當植物處于病蟲害、高溫、低溫、干旱、鹽堿、重金屬脅迫等逆境條件下時，外源噴施MeJA，其作為一種信號分子通過氣孔進入植物體內[2]，在細胞質中被酯酶水解為有生物活性的茉莉酸，大量茉莉酸與異亮氨酸形成復合物JA-Ile (jasmonoyl-isoleucine)，使植物體內茉莉酸及其衍生物的含量顯著增加，進而誘導一系列與抗逆相關基因的表達，如蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)等，使植物體內產生一些防御性化學物質，如滲透調節物質、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、 過氧化氫酶(catalase, CAT)、 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)活性變化等。有關植物抗逆性研究表明外施MeJA 在一定程度上能減緩各種生物與非生物脅迫對植物造成的傷害[3]，有效地提高植株的抗逆能力[4-5]，隨著MeJA 在植物抗逆機制中重要作用的揭示，其防御方面的作用研究也得到人們的廣泛關注，生物與非生物脅迫下外施MeJA 對植物生長調節作用和生理特性的研究，已在多種植物中有報道，如月季(Rosa chinensis)[6]、狹葉黃芩(Scutellaria regeliana)[7]、小麥(Triticum aestivum)[8]、草地早熟禾(Poa pratensis)[9]、 金葉銀杏(Ginkgo biloba)[10]、柑橘(Citrus reticulata)[11]等。

紫花地丁(Viola philippica)屬于堇菜科堇菜屬多年生草本植物，在我國除青海、西藏外其他各省區均有分布，因其具有很好的抗氧化[12]、抗菌[13]、抗炎[14-15]、抗癌[16]、抗病毒[17]等功效，被廣泛用于醫藥、食品等方面。同時，紫花地丁具有抗鹽、抗干旱以及花型優美、花色鮮艷等特性，被廣泛用于園藝栽培等方面。但是，紫花地丁在生長過程中，如果在溫度過高或通風不良的情況下，葉片表面易長葉螨，嚴重影響紫花地丁的生長發育。目前，在其他植物中已發現MeJA 具有提高植物防御能力的積極作用，但是對紫花地丁生長發育及抗逆能力是否有提高還未見報道。因此，本研究以紫花地丁為材料，通過探究外源噴施不同濃度MeJA 對紫花地丁生長及生理生化的影響，為紫花地丁的合理栽培及抗逆機制研究等方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為紫花地丁種子，采自甘肅省省委黨校草坪，成熟的蒴果裝與信封袋中讓其自然風干，然后與4 ℃下保存待用。

1.2 試驗設計

挑選顆粒飽滿的紫花地丁種子，播種至穴盤中，當其種子萌發并有4 片真葉后，進行移栽，將幼苗移栽至營養土 ∶ 蛭石 = 3 ∶ 1 (體積比)的塑料花盆中，每盆中移栽2 株幼苗，將幼苗放置在光暗周期比為12 h/12 h (時控開關控制)、溫度為22～28 ℃、濕度為48%、光照強度為9 600 lx 的培養架上進行生長。待其生長穩定，至少發育有6 片真葉時，每周在紫花地丁幼苗葉片的下表皮噴施不同濃度的MeJA (0、1.25、2.5、5、10 mmol·L-1)。每個濃度下8盆，設3 個獨立的生物學重復。

1.3 螨害指數和誘抗效果

噴施外源MeJA 第7 周后觀察并統計紫花地丁受葉螨侵染的各級葉片數，并計算螨害指數與誘抗效果，取3 個獨立的生物學重復。參照吳委林等[18]的方法，根據植株受螨害的程度將其分為0、1、2、3、4 級，0 級：葉片未受螨害，植株生長正常；1 級：葉片表面出現少量淡黃色小斑點，受害輕微，螨害面積占葉片面積的25%以下；2 級：葉面出現黃色斑，黃斑面積占葉片面積的26%～50%；3 級：葉面黃褐斑較多成片，黃褐斑面積占葉片面積的51%～75%，葉片局部卷縮；4 級：葉片受害嚴重，黃褐斑面積占葉片面積76%以上，嚴重時葉片枯萎、脫落。

計算紫花地丁葉片的螨害指數與誘抗效果：

1.4 生長指標測定

紫花地丁幼苗葉片數、葉柄長、葉長、葉寬凈生長的測定：先對MeJA 處理前植株的葉片數、葉柄長、葉長、葉寬進行測定。計數葉片數量，使用刻度尺測定其葉柄長、葉長、葉寬，數值精確到mm。然后，不同濃度的MeJA 處理7 周后，再對紫花地丁植株的生長指標進行測定，處理前后各生長指標的差值即為紫花地丁幼苗葉片數、葉柄長、葉長、葉寬的凈生長值。

1.5 抗氧化酶活性測定

取紫花地丁幼苗葉片0.2 g，洗凈后置于提前預冷的研缽中，分3 次將0.05 mol·L-1pH 7.8 的磷酸緩沖液0.6、0.5 和0.5 mL 加入到預冷的研缽中，在冰上研磨成勻漿，轉入離心管，在4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清，上清液即為粗酶液，將粗酶液儲存在4 ℃冰箱中待測定。取3 個獨立的生物學重復。氮藍四唑(NBT)法測定紫花地丁葉片中SOD的活性[19]， 愈創木酚法測定POD 活性[20]， 紫外吸收法測定CAT 活性[21]。

1.6 MDA 含量的測定

參照Bailly 等[22]的方法，利用硫代巴比妥酸法測定MDA 的含量。

1.7 LOX 活性的測定

參照王祎等[23]的方法，采用紫外分光光度法測定LOX 酶活性。

1.8 葉綠素含量的測定

采用分光光度法參照Arnon 方法[24-25]，并作部分修改，采用丙酮提取法測定紫花地丁葉片中葉綠素的含量。

1.9 可溶性糖含量的測定

參照李合生[26]的方法，利用蒽酮比色法測定紫花地丁葉片中可溶性糖含量。

1.10 數據處理

利用SPSS 17.0 分析軟件在P＜ 0.05 水平下統計分析不同濃度的MeJA 溶液對紫花地丁生長指標及生理指標的數據，用平均值 ± 標準誤差表示測定結果，數據用Origin 2018 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA 對紫花地丁抗葉螨的影響

與對照組(CK)相比，外源噴施不同濃度的MeJA溶液后，紫花地丁葉片表面侵染的葉螨數量減少，螨害指數明顯降低(P＜ 0.05)。且隨著MeJA 濃度的升高，植株抗螨能力升高，當其濃度在10 mmol·L-1時，植株幾乎無葉螨侵染，螨害指數為0.16，抗螨效果達到99.68% (表1)。

表1 外源不同濃度的MeJA 對紫花地丁抗葉螨的影響Table 1 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the resistance of Viola philippica to spider mites

2.2 外源MeJA 對紫花地丁營養生長的影響

外源噴施不同濃度的MeJA溶液，隨著MeJA 濃度的升高，與對照組(CK)相比，紫花地丁植株的葉片寬、葉片長、葉片數和葉柄長均先增加后減少，且都在濃度為2.5 mmol·L-1時達到最大值，與對照組相比，分別顯著增加了20.20%、23.39%、50.30%和23.99% (P＜ 0.05) (圖1)。

圖1 外源不同濃度的MeJA 對紫花地丁營養生長的影響Figure 1 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the vegetative growth of Viola philippica

2.3 外源MeJA 對紫花地丁葉片抗氧化酶活性的影響

外源噴施不同濃度的MeJA 溶液，紫花地丁葉片中SOD、POD、CAT 的活性均呈現一致的變化，隨著MeJA 濃度的升高，3 種酶的活性都升高(圖2)，當濃度為10 mmol·L-1時，SOD、POD、CAT 的酶活性最高，與對照組(CK)比較，紫花地丁葉片中SOD、POD、CAT 的活性分別提高了136.36%、66.90%、124.19%，說明高濃度的外源MeJA 更能夠顯著地提高紫花地丁葉片中SOD、POD、CAT 的酶活性(P＜ 0.05) 。

圖2 外源不同濃度的MeJA 對紫花地丁抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the antioxidant enzyme activities of Viola philippica

2.4 外源MeJA 對紫花地丁葉片中MDA 含量和LOX 活性的影響

MDA 是膜脂過氧化的產物，具有細胞毒性，會破壞細胞膜結構，因此其含量高低可以衡量膜脂過氧化的程度。與對照組(CK)相比，隨著外源MeJA溶液濃度的升高，紫花地丁葉片中的MDA 含量呈現逐漸降低的趨勢(圖3)。在MeJA濃度達到10 mmol·L-1時，MDA 含量最低，比對照組顯著降低了44.87% (P＜ 0.05)，表明高濃度的MeJA 溶液能夠減緩紫花地丁葉片中膜脂過氧化的程度。隨著MeJA濃度的升高，紫花地丁葉片中脂氧合酶(LOX)活性逐漸升高，與對照組相比，1.25、2.5、5 和10 mmol·L-1濃度處理的LOX 活性分別顯著提高了14.29%、24.49%、46.94%和87.76% (P＜ 0.05)，其中10 mmol·L-1處理的增幅最大。結果表明，外源噴施高濃度的MeJA 溶液，可顯著提高紫花地丁葉片中的LOX 活性。

圖3 外源不同濃度的MeJA 對紫花地丁葉片中丙二醛含量和脂氧合酶活性的影響Figure 3 Effect of exogenous MeJA concentrations on malondialdehyde content and lipoxygenase (LOX) activity in leaves of Viola philippica

2.5 外源MeJA 對紫花地丁葉片葉綠素和可溶性糖含量的影響

葉綠素是衡量光合作用的重要指標，噴施不同濃度的MeJA 后，紫花地丁葉片中葉綠素含量較對照組均呈增加趨勢(圖4)。與對照組(CK)相比，1.25、2.5、5 和10 mmol·L-1濃度處理分別增加了3.07%、5.66%、14.72%和22.62%；隨著外源MeJA 濃度的升高，與未噴施MeJA 組相比，紫花地丁葉片中可溶性糖含量也逐漸升高，當MeJA 濃度達到10 mmol·L-1時，可溶性糖含量最高，與對照組相比，增加了58.57%。

圖4 外源不同濃度的MeJA 對紫花地丁葉片葉綠素和可溶性糖含量的影響Figure 4 Effect of exogenous MeJA concentrations on the chlorophyll and soluble sugar content in leaves of Viola philippica

3 討論

MeJA 作為一種植物生長調節物質，可以促進植株生長發育，提高植物的抗蟲能力等。研究表明[27]蘋果樹(Malus pumila)噴施適宜濃度的MeJA溶液可以充當殺螨劑的作用，進而有效地防治蜘蛛螨對果樹的病害，Mageroy 等[28]用MeJA 噴灑云杉(Picea abies)的樹皮，結果發現云杉對殺樹甲蟲及其相關的植物病原真菌的抵抗力增強。孫燦[29]用不同濃度MeJA 處理黃瓜(Cucumis sativus)和葎草(Humulus japonicus)，隨著MeJA 溶液濃度的增加，植物葉片的葉長、葉寬、葉柄長、葉片數量、葉面積均增加。何偉偉等[30]設置了4 個不同濃度的MeJA 浸種處理玉米(Zea mays)籽粒，結果發現MeJA 濃度為0.5 μmol·L-1時，玉米籽粒發芽率和芽長達到最大值。晏姿等[31]用不同濃度MeJA 溶液浸泡種球及噴施香雪蘭(Freesia hybrida)，發現MeJA溶液促進了香雪蘭株高的生長。這些研究結果表明，MeJA 可以誘導植物的抗蟲性，促進植物種子萌發及植物的生長。本研究結果與上述研究一致，MeJA 也能增加紫花地丁植株對葉螨的抵抗力，同時促進紫花地丁的生長發育。

外源噴施MeJA 可有效提高植物的抗逆境與抗病蟲害的能力，主要機制在于可直接影響與植物抗逆相關的一些生理指標，如SOD、POD、CAT、LOX等酶活性，以及MDA 含量和滲透調節物質的含量等。SOD、POD、CAT 是植物抗氧化酶系統的重要組成部分，在各種生物與非生物脅迫下，植物體內會產生大量活性氧自由基，SOD 可以將這些有毒物質的活性氧自由基轉化為H2O2，然后由POD 和CAT將過量的H2O2轉變成水和氧氣，從而有效緩解逆境對植物的傷害[32]。MDA 是膜質過氧化物的產物，可以破壞細胞膜結構，能反映植物受傷害的程度[33]，本研究結果表明隨著外源MeJA 濃度的增加，SOD、CAT、POD 活性均呈上升趨勢，MDA 含量降低，這與在其他植物[34-36]中的研究結果一致，說明MeJA可以通過增加紫花地丁中SOD、CAT、POD 的活性，使植物細胞內的過氧化物及時清除，減少細胞膜脂過氧化，從而有效緩解葉螨對紫花地丁的傷害，提高紫花地丁的抗逆性。LOX 存在于植物的葉綠體膜中，在逆境脅迫下參與茉莉酸的合成，其活性的高低影響植物內源茉莉酸類物質水平，與植物的防御狀態密切相關。鞏莎[37]用MeJA 處理棗樹(Ziziphus jujube)，發現MeJA 能顯著提高LOX 等防御酶活性，且棗樹上日本龜蠟蚧(Ceroplastes japonicas)雌成蟲蜜露排泄量減少，表明MeJA 作為外源信號分子可以增強棗樹對害蟲的抵抗性。這與本研究結果一致，說明外源茉莉酸甲酯可以增強紫花地丁植株抗氧化酶活性和LOX 防御酶活性，有效增加植物的防御能力。

外源MeJA 可通過影響植物的滲透調節物質、光合作用強度來提高植物的抗逆性，可溶性糖是植物重要的滲透調節物質之一，研究表明植物中可溶性糖含量越多，植株抗逆能力越強[38]。葉綠素含量可以反映植物的光合作用強度，在一定程度上葉綠素含量越高，植株光合作用越強，逆境脅迫會使植物葉片葉綠素含量降低而影響光合作用。在本研究中，經MeJA 處理后的紫花地丁可溶性糖含量和葉綠素含量均高于對照組，說明MeJA 處理后可顯著緩解螨害脅迫對紫花地丁造成的不良影響。鄔亞紅[39]研究發現用茉莉酸甲酯噴施辣椒(Capsicum annuum)后，辣椒葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量及可溶性糖含量隨著茉莉酸甲酯濃度的升高呈現上升趨勢，辣椒葉片上的煙粉虱(Bemisia tabaci)的種群數量迅速下降。另外，研究發現用1.5 mmol·L-1的MeJA 處理接種白粉病的草地早熟禾(Poa pratensis)，結果發現白粉病斑面積減少，植株的植株體內的葉綠素含量和可溶性糖的含量均增加[9]。因此，結合前人研究與本研究結果，表明MeJA 也可通過增加紫花地丁植株滲透調節物質和葉綠素含量來提高其對葉螨的抵抗力。

4 結論

本研究結果表明，葉面噴施適宜濃度的MeJA能增加紫花地丁對葉螨的抵抗力，減少病害，促進紫花地丁的生長發育，當MeJA 的濃度為2.5 mmol·L-1時，葉片數量、葉柄長、葉寬、葉長達到最大值；外源MeJA 濃度的升高，可以顯著增加CAT、POD、SOD、LOX 活性及葉綠素和可溶性糖的含量，紫花地丁的MDA 含量隨著外源MeJA 濃度的增高，而呈現逐漸降低的趨勢，在10 mmol·L-1時達到最低。這些結果表明外源噴施MeJA 通過影響各種酶活性及相應生理指標，提高了紫花地丁對葉螨的抵抗性，從而有利于植物的生長發育。本研究為以后研究紫花地丁的合理栽培及抗逆機制研究等方面提供理論依據。