油菜素內酯對鹽脅迫下黑麥草種子萌發及幼苗生長的生理調控作用

王 丹，劉亞西，周 揚，黎 彬，聶書明

（西華師范大學生命科學學院 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室, 四川 南充 637009）

土壤鹽漬化是當前全球范圍內所面臨的生態問題，嚴重威脅著生態安全和農牧業的可持續發展[1]。探索適宜在鹽堿地栽培生產且具有較高經濟和生態價值的植物，是開發和利用鹽堿地資源較為經濟有效的途徑之一[2]。多年生黑麥草(Lolium perenne)具有耐踐踏、適應土壤范圍廣、色澤靚麗、建植速度快、抗病蟲害能力強等特性，目前已被廣泛應用于畜牧業養殖、地被植物水土保持和土壤生態修復等方面[3-4]。探索黑麥草耐鹽高效的栽培模式，不僅為土壤鹽漬化地區黑麥草農業生產及草地改良提供科學依據，而且對鹽堿地資源高效利用及農牧業的可持續發展等方面均具有重大的應用價值。

鹽脅迫擾亂了植物細胞內離子平衡，誘發細胞內積累過多的活性氧引起氧化脅迫，使胞內膜脂過氧化程度加大，進而損傷膜的完整性，從而喪失了對離子的選擇性吸收功能，最終導致植物的生理代謝紊亂，甚至植株死亡[5]。植物為了應對過多活性氧的積累對其自身產生的傷害，進化出一套復雜的抗氧化防御系統，包括各種抗氧化酶和非酶分子，來共同抵御各種環境脅迫對植物造成的不利影響[6]。有研究表明施加外源水楊酸、褪黑素、2, 4-表油菜素內酯(2, 4-epibrassinolide, EBR)和一氧化氮信號分子等可促進非生物脅迫條件下種子萌發[7-10]。

油菜素內酯(brassinosteroids, BRs)是一類不僅在植物生長發育過程中具有重要的調節作用，而且在植物抗逆性方面也發揮重要作用的植物新型激素[11]。研究表明在玉米(Zea mays)種子播種前進行BRs 浸種處理，可通過刺激植株體內抗氧化防御功能成分，有效克服鹽堿脅迫對植株的損傷[12]。EBR 對NaCl 脅迫下紫花苜蓿(Medicago sativa)幼苗根系生長抑制及氧化損傷具有緩解效應[13-14]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發現鹽脅迫條件下BRs 信號可能通過調節氣孔密度和氣孔導度來減少葉片水分散失，進而提高植物耐鹽性[15]。應用EBR 提高了鹽脅迫下水稻(Oryza sativa)的抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量[16]。在鹽脅迫下噴施EBR 緩解了辣椒(Capsicum annuum)葉片中電解質、脯氨酸和葉綠素含量的升高，進而減輕了鹽脅迫的效果[17]。EBR 抑制了番茄(Solanum lycopersicum)植株體內Na+從根部向地上部的運輸，降低了多胺濃度，最終提高了番茄的耐鹽性[18]。關于EBR 對鹽脅迫下黑麥草的影響，有研究將EBR 和鹽溶液同時加入裝有無菌黑麥草幼苗的MS 培養基中，結果表明EBR 可提高鹽脅迫下黑麥草幼苗的耐鹽性[19]。而針對EBR 對鹽脅迫下黑麥草種子萌發過程的影響、如何提高黑麥草幼苗的抗鹽性及其與滲透調節和抗氧化特性之間的關系卻鮮有報道。

基于此，本研究在鹽脅迫下，分別對黑麥草種子和幼苗進行EBR 處理，探討EBR 對鹽脅迫下黑麥草種子萌發、淀粉酶活性、幼苗生長、幼苗滲透調節和抗氧化酶特性等方面的影響，旨在為土壤鹽漬化地區黑麥草耐鹽高效栽培管理提供理論依據和生產實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑麥草雅晴(Yatsyn)種子購自百綠國際草業有限公司；EBR 購自上海源葉生物技術有限公司，用少量無水乙醇充分溶解后，用雙蒸水分別稀釋至工作液濃度。

1.2 試驗處理

種子處理包括CK 處理(蒸餾水)、EBR 處理(0.01 μmol·L-1EBR 溶液)、 NaCl 100 處理 (100 mmol·L-1NaCl 鹽溶液)、NaCl 100 + EBR 處理(100 mmol·L-1NaCl 和0.01 μmol·L-1EBR 溶液)、 NaCl 150 處理(150 mmol·L-1NaCl 鹽溶液)和NaCl 150 +EBR 處理(150 mmol·L-1NaCl 和0.01 μmol·L-1EBR溶液)。將種子置于使用處理溶液潤濕的鋪有雙層濾紙的潔凈培養皿中進行發芽試驗，每處理100 粒種子，3 次重復，在光照培養箱中進行試驗，溫度25 ℃，晝夜時長各為12 h，相對濕度70%。

幼苗生長試驗，將出芽15 d 的幼苗移栽到直徑7 cm 的方形營養缽中(營養土 ∶ 蛭石 = 2 ∶ 1，V ∶ V)，置于植物培養間中，光照16 h，溫度(26 ± 2) ℃，黑暗8 h，溫度(24 ± 2) ℃，相對濕度70%。對生長60 d的黑麥草幼苗進行葉片正面噴施，每天早上對每株葉片正面均勻噴施，連續噴施3 d。噴施完成的第2 天，進行澆灌處理，為鹽脅迫處理的開始。試驗處理包括CK 處理(噴施相同體積的蒸餾水，澆灌蒸餾水)、EBR 處理(噴施含0.1 μmol·L-1EBR 溶液，澆灌蒸餾水)、NaCl 處理(噴施相同體積的蒸餾水，澆灌含250 mmol·L-1NaCl 鹽溶液)和NaCl + EBR 處理(噴施含0. 1 μmol·L-1EBR 溶液，澆灌含250 mmol·L-1NaCl 鹽溶液)，在培養間進行正常栽培管理。

1.3 測定指標與方法

種子發芽處理第3 天時，取樣測定種子淀粉含量和α 淀粉酶活性，處理第5 天統計種子發芽勢，第12 天統計種子發芽數、株高、活力指數、鮮重、根系活力。幼苗脅迫處理第10 天取樣進行抗氧化酶活性、滲透調節物質、可溶性蛋白、可溶性糖含量、葉綠素含量等生理指標測定。

抗氧化酶活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量等指標的測定取植株葉片為試驗材料[16]；根系活力應用TTC 還原法測定，具體操作參考李合生[20]的測定步驟；淀粉含量、α-淀粉酶活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、 過氧化物酶(peroxidase, POD)活性、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)活性、可溶性糖(soluble sugar, SS)含量和可溶性蛋白(soluble protein, SP)含量測定方法根據蘇州格銳思生物科技公司的試劑盒說明書進行測定。丙二醛含量通過與硫代巴比妥酸(TBA)反應，然后進行比色的方法測定，參考李合生[20]的測定步驟。

各發芽指標計算公式如下：

式中:Gt為第t天的發芽數，Dt為相應的發芽天數。

活力指數(vitality index，VI) =GI×S。

式中:GI為發芽指數，S為發芽t時間的根長。

1.4 數據統計分析

運用Excel 2010 軟件處理試驗數據并作圖，應用SPSS 19.0 軟件對數據進行單因素方差分析，利用Duncan’s 多重比較進行差異顯著性分析(P＜ 0.05)。

2 結果與分析

2.1 外源EBR 對鹽脅迫下黑麥草種子萌發的影響

與對照相比，150 mmol·L-1NaCl 脅迫顯著降低了黑麥草種子的發芽率(P＜ 0.05)，而外源EBR 處理后黑麥草種子的發芽率較該濃度鹽脅迫顯著提高(P＜ 0.05) (表1)。100 和150 mmol·L-1NaCl 脅迫下種子的發芽勢分別比對照降低了17.96%和31.15%(P＜ 0.05)；外源EBR 處理后發芽勢分別較各自濃度鹽脅迫提高了10.95%和9.57% (P＜ 0.05)。100 和150 mmol·L-1NaCl 脅迫下種子的活力指數分別比對照降低了48.99%和70.70% (P＜ 0.05)，外源EBR 處理后種子活力指數分別較各自濃度鹽脅迫提高了23.86%和22.82% (P＜ 0.05)。100 和150 mmol·L-1NaCl脅迫下黑麥草的株高顯著降低(P＜ 0.05)，而且150 mmol·L-1NaCl 脅迫下株高降低更明顯，外源EBR處理100 mmol·L-1NaCl 后株高較該濃度鹽脅迫處理顯著升高(P＜ 0.05)。這些結果表明100 和150 mmol·L-1NaCl 脅迫均顯著抑制了黑麥草種子的萌發和生長(P＜ 0.05)，而外源EBR 處理可以緩解NaCl脅迫對黑麥草種子萌發的抑制作用。

100 mmol·L-1NaCl 和150 mmol·L-1NaCl 處理下黑麥草α-淀粉酶活性比對照分別降低了27.51%和53.44% (P＜ 0.05)，表明鹽脅迫抑制了黑麥草α-淀粉酶的活性(表1)。100 mmol·L-1NaCl + 0.01 μmol·L-1EBR 處理比100 mmol·L-1NaCl 處理的α-淀粉酶活性顯著提高15.61% (P＜ 0.05)；而150 mmol·L-1NaCl +0.01 μmol·L-1EBR 處理的α-淀粉酶活性與150 mmol·L-1NaCl 處理的無顯著差異(P ＞0.05)。鹽脅迫處理抑制了種子萌發過程中淀粉的分解，100 mmol·L-1NaCl 脅迫處理下，外源EBR 處理比無EBR脅迫處理組的淀粉含量顯著降低12.75% (P＜ 0.05)。以上結果表明EBR 能夠提高100 mmol·L-1NaCl 脅迫下黑麥草種子的α-淀粉酶活性，并進一步促進淀粉的代謝分解。

表1 外源油菜素內酯對NaCl 脅迫下黑麥草種子萌發期指標的影響Table 1 Effect of exogenous 2, 4-epibrassinolide on germination indexes of ryegrass seeds under NaCl stress

2.2 外源EBR 對鹽脅迫下黑麥草鮮重和根系活力的影響

鹽脅迫顯著抑制了黑麥草的鮮重(P＜ 0.05)，100 和150 mmol·L-1NaCl 脅迫下鮮重分別比對照降低了分別比對照降低了10.17% 和42.73% (圖1)。150 mmol·L-1NaCl 脅迫下，外源添加EBR 處理比未添加EBR 處理鮮重提高了21.37%(P＜ 0.05)。與此同時，100 和150 mmol·L-1NaCl 脅迫處理下根系活力分別比對照降低了17.32%和60.02% (P＜ 0.05)；而在150 mmol·L-1NaCl 處理下添加EBR 處理比未添加EBR 處理下根系活力顯著提高了42.91% (P＜ 0.05)。

圖1 外源油菜素內酯對NaCl 脅迫下黑麥草鮮重和根系活力的影響Figure 1 Effect of exogenous 2, 4-epibrassinolide on fresh weight and root activity of ryegrass under NaCl stress

2.3 外源EBR 對鹽脅迫下黑麥草幼苗葉片的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

250 mmol·L-1NaCl 脅迫顯著增加了黑麥草幼苗體內膜脂過氧化產物MDA 的含量(P＜ 0.05)，NaCl處理10 d 后，MDA 含量比對照顯著增加了38.42% (P＜0.05)；外源EBR 處理黑麥草幼苗體內MDA 含量比NaCl 處理顯著降低了14.57% (P＜ 0.05) (圖2)。

與對照相比，250 mmol·L-1NaCl 脅迫下，黑麥草幼苗體內SOD、CAT、POD 和GPX 活性顯著升高(P＜0.05)，而外源EBR 和NaCl 共同處理下進一步提高了黑麥草幼苗體內抗氧化酶活性(圖2)。NaCl 處理10 d后，SOD、CAT、POD 和GPX 活性分別比對照提高了21.42%、13.87%、10.67%和33.96%；外源EBR 和NaCl共同處理下SOD、CAT、POD 和GPX 活性比NaCl脅迫處理提高了12.6%、 5.11%、 8.73%和4.44%。以上結果表明外源EBR 可以進一步提高NaCl 處理下黑麥草幼苗體內抗氧化酶活性來降低MDA 含量。

圖2 外源油菜素內酯對NaCl 脅迫下黑麥草幼苗葉片丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of exogenous 2, 4-epibrassinolide on malondialdehyde and antioxidant enzyme activity in ryegrass seedling leaves under NaCl stress

2.4 外源EBR 對鹽脅迫下黑麥草幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量的影響

250 mmol·L-1NaCl 脅迫顯著增加了黑麥草幼苗體內可溶性糖和可溶性蛋白含量(P＜ 0.05)，NaCl 處理10 d 后，可溶性糖和可溶性蛋白含量分別比對照增加了28.98%和31.56% (圖3)。外源EBR 和NaCl共同處理下黑麥草幼苗體內可溶性糖和可溶性蛋白含量分別比NaCl 處理提高了13.9%和8.31%。

在正常生長條件下，外源噴施EBR 輕微增加了NaCl 脅迫下的黑麥草幼苗體內葉綠素a 含量；250 mmol·L-1NaCl 脅迫下，黑麥草幼苗體內葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量顯著下降(P＜ 0.05)，EBR 在一定程度上可以抑制NaCl 脅迫導致的葉綠素含量下降(圖3)。NaCl 處理10 d 后，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量分別比對照降低了46.54%、48.25%、43.79%和46.97%；EBR 和NaCl共同處理下黑麥草幼苗體內葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量比NaCl 處理提高了24.74%、25.18%、24.86%和8.49%。表明250 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR 能顯著改善NaCl 脅迫對黑麥草光合色素的影響。

圖3 外源油菜素內酯對NaCl 脅迫下黑麥草幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量的影響Figure 3 Effect of exogenous 2, 4-epibrassinolide on soluble sugar, soluble protein, and chlorophyll content in ryegrass seedling leaves under NaCl stress

3 討論與結論

植物在生長的不同階段對脅迫的耐受性不同，對于大多數植物而言，種子萌發和幼苗生長階段對脅迫最為敏感[21]。黑麥草種子萌發時對鹽脅迫敏感，而且隨著脅迫程度的增加，傷害程度也加重[22]。目前有研究報道表明應用水楊酸、褪黑素、EBR、一氧化氮等外源物質可以促進非生物脅迫條件下種子萌發[7-10]。Wang 等[23]研究表明，BRs 通過與乙烯合成的相互作用來減輕鹽脅迫對黃瓜(Cucumis sativus)種子萌發的抑制作用。其他研究表明，BRs與根發育的許多方面有關，如分生組織大小的維持、根毛的形成、側根的發生、重力反應、菌根的形成和豆科植物的結瘤等[24]。本研究表明，鹽脅迫降低了黑麥草種子的發芽率、發芽勢、活力指數以及發芽后的鮮重和根系活力，而EBR 緩解了鹽脅迫對黑麥草種子這些指標的影響。鹽脅迫也抑制了黑麥草種子α-淀粉酶的活性，進而導致淀粉含量顯著高于對照。EBR 提高了鹽脅迫下黑麥草種子的α-淀粉酶活性，進一步促進了淀粉的代謝分解，最終降低了黑麥草的淀粉含量。

植物對鹽脅迫的適應性和耐受性涉及復雜的生理生化反應、代謝途徑和信號調控網絡，包括分子、代謝和生理水平上對鹽脅迫的各種適應性反應[25-26]。有研究表明，鹽脅迫能導致植株幼苗活性氧代謝失調并引發膜脂過氧化作用，進而使得植株幼苗生長受到抑制[27]。本研究利用有機營養土種植黑麥草幼苗，通過葉面噴施EBR 顯著緩解了250 mmol·L-1NaCl 處理對黑麥草幼苗生長的抑制效果。正常生長條件下植物體內的活性氧代謝處于動態平衡狀態，當植物遭受逆境脅迫時，就會產生過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進而對植物造成傷害。鹽脅迫下產生的過多ROS 能引起植株細胞膜脂過氧化，MDA 是膜脂過氧化產物，其含量的高低是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標[18]。本研究中NaCl 脅迫顯著提高了黑麥草體內MDA 含量，而添加EBR 顯著降低了NaCl脅迫下黑麥草體內MDA 的含量，表明NaCl 脅迫增加了黑麥草體內膜脂過氧化程度，而EBR 降低了NaCl 脅迫下黑麥草體內膜脂過氧化程度，進而對黑麥草體內細胞完整性起到較好的保護作用。植物在進化過程中形成了活性氧清除系統用于防御脅迫產生的活性氧傷害。活性氧清除的主要酶類，能有效地清除植物體內過量的自由基，增強植物適應脅迫的能力。本研究進一步發現，黑麥草體內的SOD、POD、CAT、APX 等主要保護酶在鹽脅迫下活性增強，經EBR 處理后，這些酶的活性進一步增強，進而可以有效清除鹽脅迫下引起的過多活性氧對黑麥草細胞的傷害，這與EBR 顯著降低了NaCl 脅迫下黑麥草體內膜脂過氧化產物MDA 含量的結果相一致。這些結果也與BRs 能通過調控滲透物質含量和抗氧化酶系統等緩解鹽脅迫對燕麥(Avena sativa)種子萌發的傷害結果一致[9]。

在鹽脅迫下的黑麥草幼苗經EBR 處理后，其體內滲透調節物質可溶性蛋白和可溶性糖等含量明顯增加，滲透調節能力增強，進一步降低了鹽脅迫引起的傷害[12]。外源EBR 降低了NaCl 依賴性脂質過氧化的程度，提高了葉片細胞的滲透勢；鹽脅迫下EBR 的保護作用可能與EBR 的抗氧化作用有關，通過維持細胞內離子平衡來調節植物保持水分平衡的能力[28]。本研究表明，EBR 處理促進了黑麥草體內可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調節物質的積累，從而增強了植株在NaCl 脅迫下滲透調節的能力，最終減輕了鹽脅迫對植株造成的傷害。Oliveira 等[29]研究表明，EBR 處理改善了離子平衡，減輕了鹽脅迫對尾葉桉(Eucalyptus urophylla)幼苗的傷害程度，提高了組織的營養成分含量。寇江濤和師尚禮[13]研究表明，EBR 能減輕鹽脅迫對苜蓿幼苗的光抑制作用，加快有機物的合成，維持植株體內離子代謝平衡，進而增強苜蓿幼苗的耐鹽性。

葉綠素在植物光合作用過程中發揮著吸收、傳遞和轉化光能的作用，而且植物葉綠素含量的高低與光合作用強弱直接相關[21]。鹽脅迫會導致植物細胞中鹽離子的積累，造成葉綠素代謝平衡被破壞，進而導致葉綠素降解速度加快，嚴重時還可能破壞葉綠體結構，最終影響植物光合作用能力的強弱[21,30]。本研究中，鹽脅迫使葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量均顯著下降，而應用EBR 明顯緩解了光合色素含量的下降。表明EBR 可以通過緩解鹽脅迫下光合色素含量的下降來提高黑麥草幼苗的抗鹽性。

綜上所述，本研究結果表明應用0.01 μmol·L-1EBR 溶液對黑麥草進行浸種處理，可以有效緩解100 mmol·L-1NaCl 脅迫對黑麥草種子發芽勢和活力指數的影響，并提高了α-淀粉酶活性和根系活力。通過對黑麥草幼苗葉片噴施0.1 μmol·L-1EBR 溶液減輕了250 mmol·L-1NaCl 脅迫對黑麥草幼苗的傷害程度，本研究結果表明EBR 可能主要通過以下幾方面來緩解鹽脅迫對植物造成的傷害：一是EBR 提高了鹽脅迫下黑麥草幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量，從而增強了鹽脅迫下黑麥草幼苗的滲透調節能力；二是EBR 通過緩解鹽脅迫下光合色素含量的下降來提高黑麥草幼苗的抗鹽性；三是EBR 增強了鹽脅迫下黑麥草幼苗的抗氧化酶活性，進而有效減輕過多活性氧對黑麥草細胞造成的傷害，從而降低了膜脂過氧化產物丙二醛的含量，最終減輕了鹽脅迫對植株造成的傷害。