蛋白質氧化影響乳液穩定性研究進展

李鶴林 李 芳 吳曉娟 吳 偉

(中南林業科技大學食品科學與工程學院;稻谷及副產物深加工國家工程實驗室,長沙 410004)

食品乳液是一類重要的食品體系，通常分成兩種體系，一種是油分散在水中的體系，被稱為水包油(O/W)乳液，例如牛奶、冰淇淋等，另一種是水分散在油中的體系，也叫做油包水(W/O)乳液，如奶油、人造黃油等[1]。乳液體系通常是不穩定的，因此需要添加表面活性劑來提高乳液穩定性。蛋白質是人類最重要的營養素之一，米糠蛋白、卵清蛋白、玉米醇溶蛋白等多種食品蛋白質都具有兩親性，可作為天然的乳液穩定劑[2-4]。但是蛋白質在食品加工和貯藏過程中會不可避免地發生氧化，導致其結構和性質發生改變，進而影響其穩定乳液的效果[5-9]。近年來，部分研究還發現，氧化修飾誘導的結構變化會改變蛋白質的柔性，并且蛋白質柔性與乳化性質之間具有顯著相關性，但缺乏從柔性變化的角度對蛋白質氧化影響乳液穩定性的機理進行深入分析[10-13]。通過分析蛋白質乳液的形成機制，歸納影響蛋白質乳液穩定性的外因和內因，重點探討蛋白質柔性作為內因對蛋白質乳液穩定性的影響，進而從蛋白質柔性的角度，闡述蛋白質氧化影響乳液穩定性的機理，旨在為蛋白質乳液的開發及其在食品體系中的應用提供參考。

1 蛋白質乳液的形成機制及影響因素

1.1 蛋白質乳液形成機制

食品乳液是指一種液體以液珠形式均勻分散在另一種與其互不相溶的液體中形成的體系[14]。乳液可作為包埋風味物質[15]和生物活性物質[16]的載體。根據熱力學定律和能量最小原理，體系總會向著能量最低的狀態發展，乳液會迅速發生分離以減少界面接觸面積和自由能，發生絮凝、聚結、乳析、沉降等現象，因此通常在乳液中加入表面活性劑用于穩定乳液[17]。表面活性劑可以降低蛋白質界面張力，促使液滴破裂以形成更小的液滴，并吸附到液滴表面并形成保護性涂層，有助于乳液的形成和穩定[1, 18]。食品中表面活性劑主要分為低分子量表面活性劑(如甘油、單脂、磷脂等)和高分子量表面活性劑(如蛋白質、多糖等)，低分子量表面活性劑界面能更低，更容易吸附到界面，形成乳液的能力要好于蛋白質，但低分子量表面活性劑形成的乳液不如蛋白質乳液穩定[18, 19]。這是因為蛋白質除了降低界面張力，還可以通過非共價相互作用和二硫鍵交聯在油滴表面形成連續的黏彈性凝膠狀薄膜，蛋白質薄膜提供的空間位阻作用力有助于穩定乳液[18]。

界面蛋白的吸附是一個動態過程，如圖1所示，蛋白質首先從水相擴散到油水界面上，而后在界面處吸附并展開，最后吸附在界面上的蛋白質片段發生重排、交聯和固化。蛋白質具有兩親性，蛋白質從水相擴散到油水界面是一個自發過程，但蛋白質在界面處的吸附存在一定的能壘[16]。能壘大小取決于蛋白質結構，可以通過蛋白質去折疊來降低能壘[18]。吸附到界面以后，蛋白質發生去折疊，疏水性基團在非水相中進一步暴露，蛋白質與界面結合更加緊密且在界面處形成致密高彈性的網絡結構[19]。蛋白質在界面上的吸附特性與蛋白質乳化性質密切相關，界面膜的厚度和黏彈性對乳液的聚結穩定性有很大影響，且蛋白質的乳化性質與其在界面的擴散吸附和展開重排的速度成正相關[20]。

圖1 蛋白質吸附到油-水界面示意圖

1.2 環境因素對蛋白質乳液穩定性的影響

乳液是由兩種不混溶液體在機械剪切作用下形成[21]。若只是簡單的分散(例如純油相分散在純水相中)，即使在高能量條件下，也只會形成瞬態乳液。通過添加蛋白質可以起到穩定乳液的作用，但蛋白質的結構易受到環境影響而改變，從而影響乳液的穩定效果。研究表明，溫度、pH、離子強度等環境條件對蛋白質乳液的穩定性有顯著影響[22]。表1總結了不同環境因素對蛋白質乳液穩定性的影響。熱處理是蛋白質最常見的改性方法之一，隨著溫度的升高，蛋白質二硫鍵斷裂，發生去折疊，掩埋在蛋白質內部的疏水基團暴露，蛋白質柔性增強，降低蛋白質吸附到界面的能壘，促使蛋白質快速吸附到界面上并形成黏彈性蛋白質薄膜，乳液液滴間空間位阻作用增強，乳液穩定性也隨之增強[23-26]。pH和離子強度都可通過改變液滴間的靜電相互作用來影響乳液穩定性[27, 28]。當乳液pH值接近界面吸附蛋白等電點或乳液中離子強度逐漸增加，界面吸附蛋白發生交聯和聚集，蛋白質柔性減弱，帶電荷氨基酸殘基被掩埋在蛋白質內部，液滴間靜電排斥力降低，甚至不足以抵抗由范德華力或疏水作用力引起的液滴間相互作用，導致乳液穩定性降低[22, 29-32]。

表1 環境因素對蛋白質乳液穩定性的影響

1.3 蛋白質柔性對乳液穩定性的重要影響

溫度、pH、離子強度等環境因素只是影響蛋白質乳液穩定性的外因，諸多研究表明，這些因素都是通過改變蛋白質柔性結構來影響蛋白質乳液穩定性[22, 24-27, 29-32]。

1.3.1 蛋白質柔性

蛋白質結構中包含柔性區間和剛性區間，柔性區間是指蛋白質結構中易于發生改變的部分，而剛性區間是指蛋白質結構中不容易發生改變的部分，蛋白質結構中柔性區間與剛性區間的比例越高，則蛋白質的可塑性越強[33]。蛋白質結構會受周圍環境影響而發生運動，可能會引起氨基酸側鏈和主肽鏈的相互聚集，促使蛋白質柔性結構發生變化[34]。因而，蛋白質柔性常被定義為蛋白質中各個結構域的相對運動或多肽鏈中氨基酸殘基的重新定向松弛速率，也可以理解為蛋白質空間結構的可塑性[22]。

蛋白質柔性除了受溫度、pH、離子強度等因素影響外，高壓、超聲、輻照、脈沖電場、微波和微射流等加工技術也可以改變蛋白剛柔性區域分布[34]。但歸根結底，這些因素都是通過影響蛋白質分子內或分子間相互作用(主要包括氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和共價鍵)，進而影響蛋白質柔性[35]。蛋白質通過氫鍵與水分子發生相互作用，氫鍵鍵能的變化意味著蛋白質分子結構在不斷運動過程中暴露出的親水性側鏈基團數量發生變化，導致蛋白質柔性變化。靜電相互作用和疏水相互作用發生變化，表明蛋白質表面帶電荷氨基酸和疏水性氨基酸結構區域產生移動，柔性也隨之改變[7, 11, 36]。二硫鍵數量決定了蛋白質的去折疊程度，蛋白質去折疊程度與蛋白質柔性成正相關，因此，二硫鍵含量同樣能決定蛋白質的柔性[33, 37]。

蛋白質柔性有多種表征方法。蛋白質二級結構是表征蛋白質柔性變化最常用的方法，蛋白質二級結構中α-螺旋為剛性結構，β-折疊為柔性結構，α-螺旋與β-折疊的比值越低，則蛋白質柔性越強[10]。二硫鍵含量也可用來表征蛋白質的柔性變化，二硫鍵含量降低，表明蛋白質發生去折疊，空間結構運動性增強，柔性增強[38]。蛋白質柔性還可通過蛋白質參與分子間相互作用的表面積來判斷，表面積越大，則蛋白質柔性越強[37]。離子交換色譜法和蛋白酶水解法也可以間接表征蛋白質柔性強弱。蛋白質分子在離子交換色譜中保留時間越長，表明靜態結合能力越強，則蛋白質柔性越強[39]。另外，柔性蛋白質比剛性蛋白質更容易被蛋白酶消化，蛋白酶水解程度越高，蛋白質柔性越強[35]。

1.3.2 蛋白質柔性對乳液穩定性的影響

蛋白質乳液形成的過程中，蛋白質吸附到油水界面經歷了分子吸附、結構重排、界面擴張等復雜過程，從蛋白質天然穩態結構的角度難以準確分析蛋白質乳液穩定性的構效關系，而柔性結構分析恰好為蛋白質乳液穩定性的研究提供了較為可靠的依據。具有柔性構象的蛋白質側鏈基團和主肽鏈是不斷運動的，掩埋在蛋白質分子內部的疏水性氨基酸和帶電荷氨基酸會逐漸暴露。暴露出來的疏水性氨基酸在油水界面上與油分子相互結合，能促使蛋白質吸附到界面上并在界面上排列成完整的凝膠網絡結構，可以增強液滴間空間位阻作用力；暴露出來的帶電荷氨基酸則促使液滴間靜電斥力增強，增強的空間位阻作用力和靜電斥力可以起到穩定液滴的作用。近年來，多項研究均證明了蛋白質柔性與乳液穩定性的緊密關聯：Maruyama等[40]研究發現大豆蛋白的柔性和乳液穩定性存在一定相關性，大豆蛋白柔性的變化可影響界面吸附蛋白結構的重排速率，進而影響界面吸附行為；Li等[35]同樣發現大豆分離蛋白柔性與乳液穩定性成顯著正相關，蛋白質柔性的增加促進蛋白質在油水界面的擴散和展開，增強液滴間的空間位阻作用力，從而提高蛋白質乳液穩定性；Tang等[41]通過探索氧化牛血清蛋白結構柔性對其乳化性的影響，發現蛋白的骨架柔性對其乳液穩定性有重要影響，具有柔性結構的蛋白更易于去折疊或產生交互作用，形成黏彈性界面層?？傊?，蛋白質柔性是影響蛋白質乳液穩定性的重要因素，蛋白剛柔性區域分布及其運動性決定了蛋白質乳液穩定性的強弱。

2 蛋白質氧化

在食品原料加工和貯藏過程中，由于外界條件(加熱、輻照、腌漬、紫外線、微波、臭氧水)和內源因素(脂肪氧合酶、過氧化物酶)的影響，常伴隨著活性氧的產生，可導致食品蛋白質氧化[12, 42-48]。蛋白質氧化是由活性氧直接誘導產生，或者是與氧化應激的次級副產物反應而間接產生的蛋白質的共價修飾[49]。當蛋白質發生氧化時，氨基酸殘基側鏈和蛋白質主鏈被修飾，伴隨著蛋白質羰基的增加、巰基的減少、疏水性游離氨基酸的變化以及二級結構的改變，從而改變蛋白質結構運動性，進而影響蛋白質柔性[9, 11, 50]。蛋白質氧化也會引起蛋白質持油性、乳化性等功能性質的改變，進而影響蛋白質乳液穩定性[51]。

2.1 蛋白質氧化對蛋白質柔性的影響

如表2所示，蛋白質氧化對蛋白質柔性的影響與蛋白質氧化程度相關，隨著蛋白質氧化程度的增加，蛋白質柔性通常先增強后減弱。在輕度氧化條件下，蛋白質二級結構中α-螺旋結構所占比例減少，導致蛋白質結構中柔性區間與剛性區間的比例升高，表明蛋白質結構運動性和可塑性增強，蛋白質結構柔性也隨之增強[10, 11]。同時，蛋白質亞基變性、解離，肽鏈擴展，暴露了原本掩埋在蛋白質內部的疏水基團和可電離氨基酸，這表明蛋白質結構運動性增強，蛋白質結構趨向于柔性[7, 11]。蛋白質輕度氧化也會引起二硫鍵裂解，游離巰基含量增加，蛋白質高級結構發生去折疊，蛋白質柔性增強[36]。而隨著蛋白質氧化程度的增加，自由基攻擊蛋白質酪氨酸殘基，生成酪酰胺自由基，聚合后形成碳-碳鍵交聯的雙酪氨酸，且暴露出來的疏水性氨基酸之間因疏水締合作用發生聚集，屏蔽了蛋白質結構中的疏水位點，暴露的疏水性殘基發生共價修飾并再次掩埋在蛋白質內部，蛋白質交聯和聚集程度的增加意味著運動性的減弱，蛋白質趨近于剛性[11-13, 51]。但也有研究表明蛋白質二級結構中α-螺旋與β-折疊比例與氧化程度成正相關，即蛋白質柔性隨著蛋白質氧化程度的上升而逐漸下降[12]。

表2 蛋白質氧化對蛋白質柔性的影響

2.2 蛋白質氧化對蛋白質乳液穩定性的影響

蛋白質的乳液穩定性可以通過乳液Zeta電位、濁度以及乳液貯藏過程中的液滴尺寸和分布來表征。通常輕度氧化的蛋白質乳液穩定性更高，過度氧化的蛋白質乳液穩定性較低。在蛋白質氧化過程中，輕度氧化引起的蛋白質柔性增強，暴露出的疏水性氨基酸與油滴相互作用能促使蛋白質更容易吸附到油-水界面上，形成更加緊密的黏彈膜以增強蛋白質在液滴間形成的空間位阻作用力，且暴露在蛋白質表面的帶電荷氨基酸促使液滴間靜電斥力增強，增強的空間位阻作用力和靜電斥力可以起到穩定液滴的作用[5, 7, 10, 11, 51, 52]。同時，輕度氧化誘導的蛋白質去折疊促使掩埋在分子內部的活性位點暴露出來，蛋白質分子中的親水性氨基酸與水分子通過氫鍵連接在一起，乳液濁度降低，更加均一穩定[10, 52, 53]。隨著氧化程度增加，過度氧化引起蛋白質剛性增強，疏水性氨基酸和帶電荷氨基酸被重新掩埋在蛋白質內部，蛋白質吸附到油-水界面的難度增加，難以在界面上形成完整的凝膠網絡結構，液滴間空間位阻作用力和靜電斥力的減弱促使液滴間相互聚集，且原本的可溶性成分會通過共價和非共價相互作用轉變為不溶性成分，乳液穩定性降低[5, 10, 52-54]。還有部分研究認為，蛋白質乳化活性和乳液穩定性隨氧化程度的增加而逐漸降低，原因是隨著蛋白質氧化程度的升高，蛋白質結構中的疏水基團逐漸掩埋到蛋白質內部，且二硫鍵數量增加，而蛋白質輕度氧化條件下的疏水基團并沒有經歷暴露在表面的過程且二硫鍵也未發生斷裂[12, 13]。因此，蛋白質乳液穩定性隨著蛋白質氧化程度的變化趨勢主要分為兩種(圖2)。一是輕度氧化的蛋白質分子帶電荷氨基酸和疏水性氨基酸暴露出來，氫鍵和二硫鍵斷裂，結構柔性增強，蛋白質更容易吸附在油滴表面并排列成完整的凝膠網絡結構，所形成的乳液液滴間靜電斥力和空間位阻作用力增強，乳液穩定性上升；隨著蛋白質氧化程度的增加，過度氧化的蛋白質發生交聯和聚集，蛋白質結構更加趨近于剛性，引起蛋白質表面疏水性氨基酸和帶電荷氨基酸數量減少，形成的乳液空間位阻作用力和靜電斥力減弱，蛋白質乳液穩定性也隨之減弱。另一種趨勢與圖2中的過度氧化趨勢相一致，即隨著蛋白質氧化程度的增加，蛋白質結構中二硫鍵含量增加且α-螺旋與β-折疊比例上升，蛋白質剛性增強，乳液穩定性減弱。由此可見，蛋白質氧化通過影響蛋白質柔性進而改變乳液穩定性的機理十分復雜，可能受到不同蛋白質種類、不同氧化體系、不同氧化程度的協同作用。

注：▲—▲氫鍵；■—■二硫鍵；△—△疏水相互作用；□—□靜電相互作用。圖2 蛋白質氧化影響乳液穩定性示意圖

3 結論與展望

蛋白質氧化會誘導蛋白質柔性發生改變，從而影響蛋白質分子間的空間位阻作用力和靜電力，最終對蛋白質乳液穩定性產生影響。但蛋白氧化影響蛋白質柔性的機理尚未明確，可能受到不同蛋白質種類、不同氧化體系、不同氧化程度協同作用的影響。目前關于蛋白質氧化對蛋白質乳液穩定性影響的研究主要集中在不同種類蛋白質在氧化條件下的乳液表征以及氧化條件下對蛋白質結構的影響，對蛋白質柔性的研究主要集中在蛋白質二級結構中α-螺旋與β-折疊比例，缺乏更為全面的柔性研究。因此，后續可以從以下兩個方面進行更深入的研究：一方面，對蛋白質氧化過程中的柔性變化進行更為全面的表征，以期能夠更為精準的表達蛋白質氧化對蛋白質柔性的影響，進而解釋蛋白質氧化對蛋白質乳液穩定性的影響；另一方面，分析由不同蛋白質種類、不同氧化體系、不同氧化程度的協同作用引起柔性變化的機制，進一步探究蛋白質氧化對蛋白質乳液穩定性的影響機理。