基于大孔吸附樹脂純化羅漢果甜苷V的工藝優(yōu)化研究

劉庚貴 何安樂 黃華學 黃俊 熊瑤

【摘 要】以羅漢果鮮果為原料，通過單因素和多指標正交試驗優(yōu)化基于大孔吸附樹脂純化羅漢果甜苷V的工藝。結果表明：大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度為60%、上柱流速為1 BV/h、徑高比為1∶4.5、pH值為8.0，最佳工藝參數(shù)得到98.8 g高純度天然羅漢果甜苷V產品，含量為71.1%。上柱流速對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的重量與含量都具有顯著的影響，同時乙醇濃度對重量也有顯著影響，徑高比和pH值對重量與含量影響不顯著。

【關鍵詞】羅漢果;甜苷V;正交試驗;多指標;優(yōu)化

【中圖分類號】TS202.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2021）06-0042-03

0 引言

羅漢果甜苷V，是從羅漢果果實中提取的極甜的非糖類物質，它的甜度是蔗糖的300倍且不含任何熱量，是一種不影響正常人血糖含量、安全且對人體有多種藥理活性的天然甜味劑。近幾年，國際市場上羅漢果甜苷V的消費量呈現(xiàn)強勁增長趨勢，在食品飲料行業(yè)尤為顯著。例如，“可口可樂”（美國）、“通用磨坊”（法國）、“喬巴尼”（美國）等大型的食品飲料企業(yè)都使用羅漢果甜苷V作為甜味劑[1]。據(jù)Innova Database最新數(shù)據(jù)公布，2011年，羅漢果甜苷V的消費量接近20 t/d，2015年消費量接近300 t/d，2017年1～5月，單在美國市場上發(fā)布的使用羅漢果苷V作為甜味劑的產品就達217種，同比增加140%。預計到2020年，全球羅漢果甜苷市場規(guī)模將從2016年的約2.5億美元增長到超過10億美元，年復合增長率超過40%。國家衛(wèi)健委也于2017年1月1日正式實施《食品安全國家標準——食品添加劑羅漢果甜苷》，自此，羅漢果甜苷可作為食品添加劑應用于各類食品中[2]。市場研究咨詢公司CCM認為，隨著羅漢果甜苷特有的低糖低熱量特點及其下游飲料行業(yè)的應用，預計2020年羅漢果甜苷V中國市場規(guī)模可呈現(xiàn)400%的增長，因此羅漢果甜苷V在國內外都具有非常大的市場前景。此外，受種植環(huán)境限制，羅漢果目前只在中國生長和培育，為了實施原產地保護，我國立法禁止將羅漢果的種子和遺傳基因帶出國外，因此羅漢果甜苷只能在中國生產，這對于國內的羅漢果甜苷生產企業(yè)是不可錯失的機遇。

1 試驗材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 原材料

羅漢果鮮果（湖南華誠生物資源股份有限公司提供）。

1.1.2 試劑

羅漢果甜苷V（≥98%）AR、無水乙醇AR、氫氧化鈉AR、鹽酸AR、乙腈AR等。

1.2 主要儀器

大孔吸附樹脂LX-100B（陜西省西安市西安藍曉科技新材料股份有限公司生產）、高效液相色譜儀（型號：Waters 2695）、DDSJ-308A型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司生產）、分析天平（日本島津儀器有限公司生產）等。

2 方法

2.1 羅漢果甜苷V含量測定方法

羅漢果甜苷V含量測定依照團體標準《T/CCCMHPIE 14-2016》附錄A.4中規(guī)定的方法進行測定[3]。

2.2 工藝路線

（1）羅漢果上柱液的制備：將新鮮的羅漢果通過連續(xù)逆流提取設備浸提，制得的浸提液依次過碟式分離機和陶瓷膜后，得羅漢果清液（上柱液）備用。

（2）大孔吸附樹脂層析柱的準備：將1 L LX-100B型大孔吸附樹脂裝入玻璃層析柱內（濕法裝柱），然后用4 L 95%乙醇以0.5 BV/h流速循環(huán)洗柱12 h后，用去離子水洗柱至無醇味，待用。

（3）純化層析上柱：將制得的羅漢果上柱液調節(jié)pH后，以一定的流速上柱，流出液有甜感即停止上柱。

（4）洗柱與解吸：停止上柱后，用去離子水以1 BV/h進行洗柱至中性，然后以3倍柱體積、一定濃度的乙醇水溶液，以一定的流速解吸，收集解吸液。

（5）濃縮與干燥：將收集的解吸液進行真空濃縮和微波干燥，最后稱重與檢測。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Office 2020軟件，數(shù)據(jù)分析處理采用SPSS 8.0軟件。

2.4 大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)化方法

在單因素試驗的基礎之上，以乙醇濃度（A）、上柱流速（B）、徑高比（C）及pH值（D）4個因素3個水平做多指標正交試驗表L9（34）進行試驗，對制得羅漢果甜苷V重量及含量進行綜合評分[4-5]。正交試驗因素水平表見表1，多指標設計及結果見表2。

3 結果與分析

3.1 正交試驗結果分析

對乙醇濃度（A）、上柱流速（B）、徑高比（C）及pH值（D）4個單因素進行正交試驗設計并針對重量和含量2個指標進行考察和分析，同時進行方差分析，從而確定羅漢果甜苷V層析的最佳工藝參數(shù)及影響主次因素順序，其重量和含量結果見表2。

針對制得羅漢果甜苷V產品的重量情況來看，由表1可以看出，大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的最佳工藝參數(shù)為A2B3C2D3，即解吸乙醇濃度為60%、上柱流速為1.5 BV/h、徑高比為1∶4.5、pH值為8.0。4個因素對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V影響的主次因素為B>A>D>C。說明上柱流速對制得的質量影響最大，其次是乙醇濃度，再次是pH值，最后是徑高比。

針對制得羅漢果甜苷V產品的含量情況來看，由表1可以看出，大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的最佳工藝參數(shù)為：A3B1C3D3，即解吸乙醇濃度為70%、上柱流速為0.5 BV/h、徑高比為1∶6.0、pH值為8.0。4個因素對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的影響的主次因素為A=B>D>C。即說明乙醇濃度和上柱流速對產品含量的影響最大，且兩者的影響相同，其次是pH值，最后是徑高比。

乙醇濃度對各指標的影響：從表3可以看出，乙醇濃度對重量和含量的極差都是最大的或者其次的，也就是說，乙醇濃度對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的影響最大。由于高濃度乙醇成本較高，綜合考慮A2和A3，選擇最佳方案為A2，即乙醇濃度為60%。

上柱流速對各指標的影響：從表3可以看出，上柱流速對重量和含量的極差都是最大的或者等同，也就是說，上柱流速對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的影響最大。綜合考慮B3和B1，折中選擇最佳方案為B2，即上柱流速為1BV/h。

徑高比對各指標的影響：從表1可以看出，徑高比對重量與含量的極差都是最小的，即影響最小，也就是說，徑高比對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的影響最小，綜合考慮C2和C3，折中選擇最佳方案為C2，即徑高比為1∶4.5。

pH值對各指標的影響：從表1可以看出，pH值對重量與含量的極差都是較大的，即影響較大，也就是說，pH值對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的影響較大，綜合考慮D3和D3，選擇最佳方案為D3，即pH值為8.0。

通過對各因素對兩個指標影響的綜合分析，得到理論上的最佳工藝參數(shù)為A2B2C2D3，即乙醇濃度為60%、上柱流速為1 BV/h、徑高比為1∶4.5、pH值為8.0。

3.2 方差分析

為了判斷以上4種受控因素對實驗結果的影響情況，將多指標正交表進行方差分析，找出其影響質量和含量的主要來源。正交實驗的方差分析結果見表4。

由表4可以看出：A和B因素對感官評價得分的影響顯著性，C和D因素對重量的影響不顯著。說明乙醇濃度和上柱流速對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V具有顯著的影響。同時，B因素對含量的影響呈現(xiàn)顯著性，B、C和D 3個因素對含量的影響不顯著。說明上柱流速對含量具有顯著影響。

綜上所述，上柱流速對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的重量與含量都具有顯著的影響，同時乙醇濃度對重量也有顯著影響，徑高比和pH值對重量與含量影響不顯著。

大孔吸附樹脂純化過程是一個吸附與競爭吸附的過程，大孔吸附樹脂的官能團與有效成分之間必須發(fā)生有效近距離接觸，同時保持一定的時間，在吸附過程中周圍環(huán)境要保持相對穩(wěn)定，這就需要有效成分隨同上柱液保持恒定的流速流經(jīng)大孔吸附樹脂的孔隙，確保連續(xù)吸附，流速也不能太快，從而確保吸附完全，否則會造成上柱泄露或吸附不飽和。

乙醇作為常用的解吸溶劑，其濃度的高低直接決定最終產品的品質，濃度過高會使大量的雜質隨同被解吸下來導致含量偏低，反之，濃度過低則可能會導致解吸不完全，最終產量降低。

3.3 驗證試驗

根據(jù)最佳工藝參數(shù)A2B2C2D3，即乙醇濃度為60%、上柱流速為1 BV/h、徑高比為1∶4.5、pH值為8.0。重復試驗，并進行質量和含量的測定，得到98.8 g、含量為71.1%的高純度天然羅漢果甜苷V產品，與理論值預期相符。

4 結論與建議

4.1 結論

（1）大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度為60%、上柱流速為1 BV/h、徑高比為1∶4.5、pH值為8.0。

（2）驗證試驗得到98.8 g、含量為71.1%的高純度天然羅漢果甜苷V產品，與理論值預期相符。

（3）上柱流速對大孔吸附樹脂層析純化羅漢果甜苷V的重量與含量都具有顯著的影響，同時乙醇濃度對重量也有顯著影響，徑高比和pH值對重量與含量影響不顯著。

4.2 建議

在本試驗設計過程中，在羅漢果上柱液的處理過程中，只涉及簡單的提取、碟式分離和陶瓷膜過濾，沒有對浸提液進行深入的除雜工藝，如脫蛋白、脫鞣質、脫去大分子等。如果能通過超濾膜、絮凝沉淀及冷凍脫蛋白等方式進行進一步的純化，然后再進行上柱層析純化，極可能大幅度提高純化效果。

本試驗設計只針對質量和含量進行考察，未對羅漢果甜苷V產品的食品感官進行評定。羅漢果甜苷V作為食品甜味劑，其口感滋味極為重要，口感不佳的產品很難有好的市場價值，后續(xù)試驗應重點考察純化過程對口感滋味的影響。

本試驗中在解吸環(huán)節(jié)只涉及一個梯度解吸，下一步試驗可以考慮多個梯度解吸，如第一次解吸用低濃度乙醇溶液，然后再用高濃度乙醇溶液解吸，同時考慮各種梯度乙醇溶液解吸對制得不同規(guī)格羅漢果甜苷V產品的口感影響，這對于未來制得高含量和口感極佳的羅漢果甜苷V產品具有重大的意義。

參 考 文 獻

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[3]廖秋梅，胡志娟，李健，等.羅漢果中Vc的高效液相檢測及提取方法研究[J].輕工科技，2020，36（9）：8-10，64.

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[5]黎海彬，張越華.大孔樹脂吸附分離羅漢果皂苷的動力學研究[J].食品科學，2010，31（17）：124-128.