濕地植物節節木賊和條穗苔草根際溶鎘微生物篩選及其促生特性研究

唐志遠劉可星陳金峰

(1.佛山市新城園林綠化工程有限公司，廣東 佛山 528315；2.華南農業大學資源環境學院，廣東 廣州 510640；3.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640)

重金屬鎘污染是許多國家面臨的一個比較嚴重的農業土壤污染問題，已成為一個全球性的環境問題，具有毒性大、長期性和難修復等特點。我國農田鎘污染較為嚴重，據測算，我國耕地土壤重金屬污染概率為16.67%，約占我國耕地總面積的1/6，其中鎘的污染概率為25.20%，遠超過另外7種重金屬(砷、鋅、鉻、汞、銅、鎳和鉛)[1]。生長在鎘污染耕地里的農作物吸收富集重金屬，造成農產品重金屬含量超標，長期食用鎘超標的農產品，會造成大量的鎘在人體富集，破壞人體正常的生理生化機能，甚至導致癌癥[2]。

耕地鎘污染對食品質量安全和人們健康造成了巨大的威脅，亟待修復。當前，重金屬鎘污染土地的修復方法主要有物理法、化學法和生物法3大類，常規的物理或化學方法往往見效快，但是存在成本高、二次污染等問題，難以用于大規模的重金屬污染地修復[3]。近半個世紀以來，世界各地陸續發現一些植物可在體內大量富集重金屬，這類植物被稱為超富集植物，通過人為收割即可永久性地將土壤中的重金屬去除[4]。采用這種植物修復的方法提取土壤中的重金屬具有低成本、易操作,不會對土壤造成破壞等優點[3]，日益受到廣泛的關注，但是卻遇到了植物生物量低、提取量不大和植物根際重金屬生物有效性低等問題[5]。

通過土壤微生物的代謝活動促進超富集植物的生長，增加植物根際重金屬生物有效性，成為近年來強化植物提取效率的重要研究方向。研究發現，土壤細菌可通過多種途徑，如分泌有機酸、降低土壤pH值、溶解或螯合重金屬等方式，提高土壤中的金屬遷移率或生物有效性；土壤細菌也可通過分泌植物生長激素、合成ACC脫氨酶(一種有效降低逆境脅迫下乙烯含量的酶)、溶解土壤磷等方式，增加植物營養供給，促進植物生長[6]。近年來，擁有重金屬溶解或植物促生能力的菌株不斷被發現。如，夏娟娟等[7]從菜園土壤中篩選獲得了分屬芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)和黃單胞菌屬(Xanthomonas sp.)的2株細菌，發現2株菌均能夠顯著增加土壤中重金屬鎘的有效性，加菌情況下土壤有效鎘比對照分別增加了17.02%～100%和36.17%～61.80%。蔣淼等[8]從龍葵根際分離到了4株細菌(Lysinibacillus sp.、Beijerinckia fluminensis、Achromobacter animicus和Herbaspirillum huttiense)，能通過分泌生長素IAA或產鐵載體或溶解土壤磷等方式促進植物生長，從而增強植物重金屬修復效率。

植物根際環境存在大量代謝活躍的微生物群落，是天然的篩選溶鎘或促生菌的資源庫。本研究對重金屬鎘污染地區的濕地植物群落根際土壤中的微生物進行了篩選，以期獲取既能夠溶解重金屬又能促進植物生長的微生物資源，用以協助植物修復重金屬鎘污染土壤，增強植物修復的效率。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

重金屬污染土壤(MT)取自廣東省河源市連平縣境內鋸板坑礦區附近忠信河河岸濕地植物群落根際。濕地植被群落以節節木賊(Equisetum ramosissimum)和條穗苔草(Carex nemostachys)混生群落為主。土壤的基本理化性質如表1。

1.2 培養基和試劑

1.2.1 培養基

低磷有氮固體培養基：蔗糖10g，(NH4)2SO41.0g，K2HPO40.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，121℃下濕熱滅菌20min。

牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，121℃下濕熱滅菌20min。

菌株初篩培養基：CdSO4·8H2O配成10g·L-1的溶液,單獨滅菌,然后與低磷有氮固體培養基混合倒平板，重金屬Cd濃度為50mg·L-1。

菌株復篩培養基：稱取CdCO30.1g，加入100mL低磷有氮液體培養基中，pH 7.2，121℃下濕熱滅菌20min。

磷酸鈣培養基：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)210.0g，蒸餾水1.0L，pH值7.0，121 ℃滅菌20min。

改良蔗糖-天冬氨酸培養基(Modified sugar-aspartic acid,MSA)：蔗糖20.0g，L-天冬氨酸2.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水1000mL，調節pH為7.0，121℃下濕熱滅菌20min。

低鹽蔗糖培養基(Sucrose minimal salts,SMS)：蔗糖10g，(NH4)2SO41g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母提取物0.5g，CaCO30.5g，NaCl 0.1g，pH 7.2，121℃下濕熱滅菌20min。

加色氨酸的SMS培養基：添加0.5mg·mL-1的色氨酸，其余成分一致。

液體培養基為固體培養基不添加瓊脂，其余成分一致。

1.2.2 試劑

CdCO3、Ca3(PO4)2、鉻天青S、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)、吲哚-3-乙酸(3-IAA)為分析純。有機酸標準品(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、丁二酸)均為分析純。

鉻天青S(CAS)檢測液：稱取0.079g CAS溶于50mL蒸餾水中，再加入10mL 1mmol·L-1的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol·L-1的稀鹽酸)，記作溶液A。稱取0.069g十六烷基三甲基溴化銨溶于40mL蒸餾水中，記作溶液B。將溶液A沿燒杯壁緩緩加入溶液B中，攪拌混勻即得CAS檢測液。

PC比色液：稱取FeCl312g溶于300mL蒸餾水,然后緩慢加入429.7mL的濃H2SO4(質量分數98%)，待冷卻后定容至1L,測定范圍0.3～20mg·L-1。

S2比色液：稱取4.5g FeCl3溶于300mL蒸餾水,然后緩慢加入587.4mL質量分數98%的濃H2SO4，待冷后定容至1L，測定IAA范圍5～200mg·L-1。

Salkowski’s顯色劑:150mL濃硫酸溶于250mL蒸餾水中，加入7.5mL 0.5mol·L-1的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol·L-1的稀鹽酸)。

1.3 耐鎘菌株篩選與種子液制備

稱取10g土壤加入100mL低磷有氮液體培養基中，在30℃，200rpm條件下搖床培養2h，靜置30min。用移液槍移取100μL土壤懸液，用涂布棒將土壤懸液均勻涂布在含有50mg·L-1Cd初篩培養基上，涂布完成后，平板放置3min，在恒溫培養箱中30℃倒置培養2d，待長出菌落后在平板上挑取分離較好、生長豐滿的細菌單菌落，在含有Cd濃度50mg·L-1的初篩培養基上劃線純化直至出現單菌落，鏡檢，轉至斜面4℃保存，獲得耐鎘菌株。

將耐鎘菌株用牛肉膏蛋白胨固體培養基活化18h后，挑取菌株到牛肉蛋白胨液體培養基中，于30℃條件下150rpm搖床培養18h，獲得菌株的種子液。

1.4 不同菌株溶鎘能力測定

將耐鎘菌株的種子液以1%的接種量加入裝有100mL復篩培養基中,同時設1%無菌液體培養基作為對照。每個處理設3個重復。30℃下，150rpm培養48h。培養結束后，將培養液在5000r·min-1條件下離心10min,取上清液，0.45μm濾膜過濾。用TAS-986原子吸收儀測定濾液中鎘濃度，評價耐鎘菌株的溶鎘能力，獲得溶鎘能力強的菌株。

1.5 溶鎘能力強菌株產有機酸測定

將溶鎘能力強的菌株的種子液以1%的接種量接入100mL低磷有氮培養基中,同時設1%無菌液體培養基對照。每個處理設置3個重復。30℃下，150rpm培養48h后,測定培養液pH，在5000r·min-1下離心10min,取上清液，用0.45μm濾膜過濾，參照秦忠雪等[9]研究方法用高效液相色譜法測定濾液中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、丁二酸的含量。

1.6 溶鎘能力強菌株溶磷能力測定

將溶鎘能力強的菌株種子液以1%的接種量接入100mL磷酸鈣培養基中,同時設1%無菌液體培養基對照。每個處理設置3個重復。置于30℃搖床上，150r·min-1振蕩培養3d后，將發酵液轉移至離心管中，在5000r·min-1條件下離心10min,取上清液，采用鉬銻抗比色法測定上清液中磷濃度。

1.7 溶鎘能力強菌株產鐵載體能力測定

將溶鎘能力強的菌株種子液以1%的接種量接入100mL MSA液體培養基中,同時設1%無菌液體培養基對照。每個處理設置3個重復。30℃、150r·min-1條件下培養2d，5000r·min-1離心15min，移取上清液4mL加入4mL CAS檢測液，充分混勻，于25℃下靜置1h，用雙蒸水作參比，于波長630nm處測定樣品的吸光值(As)和對照的吸光值(Ar)。按照鐵載體活性單位SU的定義(SU=[(Ar-As)/Ar]×100)，計算不同菌株的As/Ar。依據計算結果對細菌產鐵載體能力進行劃分：As/Ar以0.2為間隔，從1.0～0每減小0.2增加一個加號，加號越多表示產鐵載體能力越強。

1.8 溶鎘能力強菌株產生長素IAA能力測定

將溶鎘能力強的菌株的種子液以1%的接種量接入100mL添加色氨酸或不添加色氨酸的SMS液體培養基中,同時設1%無菌液體培養基對照。每個處理設置3個重復。置于30℃搖床上，150r·min-1振蕩培養3d后，將發酵液轉移至離心管中，在5000r·min-1條件下離心10min,上清液在4℃保存備用。

以3-IAA配制2組IAA標準溶液：第1組濃度依次為2.5mg·L-1、5.0mg·L-1、7.5mg·L-1、10.0mg·L-1、12.5mg·L-1、15.0mg·L-1、17.5mg·L-1；第2組濃度依次為25mg·L-1、50mg·L-1、75mg·L-1、100mg·L-1、125mg·L-1、150mg·L-1、175mg·L-1。分別取4mL，在第1組中加入等量的PC比色液，在第2組中加入等量的S2比色液，黑暗靜置30min，取出立即用分光光度計測定OD530，重復3次，制作標準曲線。

將4mL上清液和4mL Salkowski’s顯色劑混合后放置在黑暗中30min，以添加比色液的空白對照調零，在530nm處讀取顯現的粉紅色的吸光度，根據PC比色液和S2比色液所測定的濃度范圍，選用相應的標準曲線，確定待測菌株分泌IAA的量。

1.9 菌株16s rDNA測序

菌株送至廣州基迪奧生物科技有限公司測定16s rDNA基因序列。

1.10 數據統計分析

以Microsoft Excel和IBMSPSSStatistics 22處理試驗數據，Microsoft Excel和Origin 9.0繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 重金屬鎘耐受菌株篩選

從節節木賊和條穗苔草群落根際土壤中共篩選得到6株菌，分別命名為MT15、MT16、MT17、MT18、MT19、MT20，6株菌均能在鎘濃度為50mg·L-1的低磷有氮培養基上生長。

2.2 菌株鎘溶解能力

菌株MT18、MT19和MT20有溶解CdCO3的能力，菌株MT15、MT16和MT17不具備溶鎘能力。菌株MT18、MT19和MT20對培養基中CdCO3的溶出率高達65%～75%，使得溶液中存在高濃度的Cd2+(433.67～517.07mg·L-1)。3株溶鎘菌的溶鎘能力相當，其中MT19的溶鎘能力最強，見表2。

表2 不同菌株溶鎘能力

2.3 菌株有機酸分泌能力

對具有溶鎘能力的3株菌MT18、MT19和MT20分泌有機酸的情況分析發現，3株菌均能夠分泌草酸、乙酸和檸檬酸，MT18和MT19能夠生產乳酸，未在3株菌的培養液中檢測到酒石酸和丁二酸。3株菌均以乙酸的產量最高，其次是檸檬酸、乳酸和草酸。不同菌株分泌有機酸的量有差異,乙酸和檸檬酸分泌量，菌株MT18>MT19>MT20，草酸分泌量MT19大于其它2株菌。3株菌均能夠使培養液pH大幅下降，見表3。

表3 不同菌株間分泌有機酸含量及溶液pH

2.4 菌株溶磷效果

3株菌的溶磷能力如圖1所示，3株菌均能溶解大量的磷，溶液中磷的濃度均在500mg·L-1以上，其中MT20溶解磷的能力最強。

圖1 不同菌株溶磷能力

2.5 菌株產鐵載體能力

3株菌產鐵載體能力如表4所示。3株菌均具有產鐵載體活性，其中MT18的活性最高41.63%，產鐵載體能力最強。

表4 不同菌株鐵載體產生能力

2.6 菌株產IAA含量

3株菌產IAA的情況如圖2所示。在無色氨酸補充時，僅有MT19和MT20能夠產生IAA；在添加色氨酸情況下，3株菌均能產生IAA，而且產量普遍高于無色氨酸條件，其中MT20分泌IAA的能力最強。

圖2 不同菌株產IAA能力

2.7 菌株鑒定

對3株溶鎘菌中分泌IAA和溶磷能力比較強的MT20進行了16s rDNA測序分析，發現MT20與腸桿菌屬細菌(Enterobacter sp.)有99.66%的相似度。

3 討論

植物根際是各種土壤微生物最為活躍的微環境，植物根系分泌物為微生物提供碳源或者調控微生物的生理活動，微生物又通過代謝產物與植物根系相互作用，共同造就生化、生理和生態過程極為復雜的根際微環境。研究植物根際的微生物，揭示根際微生物與植物之間的相互關系及其形成原理，對于污染環境修復、農業生產等具有重要意義。本研究從重金屬污染礦區的濕地植物群落根際中篩選得到3株能夠溶解重金屬、分泌有機酸、溶磷、分泌鐵載體和生長素IAA的菌株。其中MT20經16s rDNA鑒定為腸桿菌屬細菌。

腸桿菌屬的一些菌株已被證明具有明顯的促生能力。Kim等[10]從日本石竹(Dianthus japonicus thumb.)根際篩選了一株腸桿菌(Enterobacter sp.EJ01)能夠分泌IAA、ACC脫氨酶，調節植物基因表達，提高活性氧清除能力，增強番茄(Lycopersicon esculentum var.Mill)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)抗鹽脅迫能力。Jetiyanon[11]報道了一株在泰國發現的能夠促進黃瓜、番茄和辣椒等多種作物生長的腸桿菌細菌(Enterobacter asburiae strain RS83)，具有類似的分泌IAA、溶磷、產鐵載體、固氮等生理生化性狀。Pramanik等[12]從重金屬污染地水稻根系分離到了一株腸桿菌(Enterobacteraerogenes MCC 3092)表現出分泌IAA、固氮、溶磷、合成ACC脫氨酶等特性，并能顯著提高植物抗逆性，促進重金屬脅迫下水稻生長。可見，腸桿菌屬細菌可能具有增強植物在逆境下抗脅迫、促進植物生長的能力，這對于修復重金屬污染土壤尤為重要。

一些腸桿菌屬的細菌也被報道具有增強植物根際重金屬有效性的能力。如，Enterobacter sp.FM-1能夠增加積雪草(Centella asiatica)、水蓼(Polygonum hydropiper)和酸模葉蓼(Polygonum lapathifolium)根際生物有效態鎘的含量，并推測Enterobacter sp.FM-1的這種能力可能與其分泌鐵載體、降低根際環境pH等性狀有關[13,14]。

本研究篩選到的腸桿菌MT20均具有類似于Kim等[10]、Pramanik等[12]和Li等[13,14]報道的性狀，可推測MT20具有促進植物修復重金屬植物的潛力，但是在實際修復實踐中，植物的修復效率還受到土壤類型、植物種類和接種菌劑量的影響，因此MT20等微生物的具體促生促修復效果有待進一步試驗研究。

4 結論

重金屬污染區濕地植物根際存在具有溶鎘和促生潛力的微生物。本研究篩選獲得了6株耐鎘菌株，其中有3株(MT18、MT19和MT20)能夠分泌草酸、乙酸和檸檬酸等有機酸，降低溶液pH，溶解碳酸鎘和磷酸鈣，產生溶鎘溶磷效果。此3株菌也均能分泌鐵載體和IAA，因而具有促生潛力。經16s rDNA鑒定，MT20為腸桿菌屬細菌。