不同的樣品前處理方式在氯霉素殘留快速檢測中的應用情況探討

張家意丘韶麟陳苑廖瑋

(1.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東 廣州 511442； 3.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442)

引言

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗菌藥物，對大部分細菌有抑制、殺菌作用。正因其抑菌性強、藥效佳，氯霉素曾在水產、畜禽養殖業中被廣泛使用，使得養殖業產業穩定增益。從應用演化成濫用，氯霉素殘留對動物、人體都有著極大危害，至今仍威脅我國水產品的安全，危害著產業發展和群眾生命健康的同時也對我國國際地位造成影響。根據農村農業部第250號公告[1]《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》，嚴禁氯霉素藥物在動物源食品中使用，可見政府對違禁藥物的監管力度大，也從側面表現問題的嚴峻性。2016年高裕鋒等[2]對廣東省部分地區市場銷售的150批次水產品進行氯霉素殘留情況調查，調查結果顯示，氯霉素檢出率為11.33%。2019年宋安華等[3]對廣州市農貿市場抽檢的2702批次水產品進行快篩分析，分析結果得出，蝦類的氯霉素殘留不合格率達到17.39%。

目前，最常見檢測氯霉素殘留的方法有微生物法、免疫分析法、色譜法、串聯質譜法，以及新型技術，如分子印跡法、電化學傳感器、生物芯片法、拉曼光譜等[4]。其中，免疫分析法主要包括酶聯分析法(ELISA)、膠體金免疫分析法(GICA)等。國家市場監管總局發布的2019年第41號公告[5]《保健食品中西地那非和他達拉非的快速檢測 膠體金免疫層析法》等13項食品快速檢測方法里發布了《KJ201905水產品中氯霉素的快速檢測 膠體金免疫層析法》。膠體金免疫層析法是應用于快速快篩方法和產品中最多的快檢技術，其優點在于特異性強、靈敏度高、檢測時間短，適用于現場大批量樣品的篩查檢測。隨著國家推動快速檢測方法，對快速檢測工作的規范管理要求也在不斷提高。李濤等[6]對于水產品中氯霉素快速檢測產品的驗證性評價及分析中表明，通過對氯霉素快速檢測試劑盒進行技術指標的評價，符合要求的適宜在現場實際監管中推廣使用。

膠體金免疫層析法也存在缺點，產品性能方面，會出現假陽性、假陰性的現象；產品呈現效果方面，會出現顯色效果不佳、斷線影響結果判斷等。因此，此方法對于樣品基質的適用性和前處理方法仍需要不斷改進。本次實驗是通過使用符合國家規定的快速檢測方法以及性能評價符合規范要求的快檢產品來完成水產品中氯霉素殘留的快檢實驗，在氯霉素快檢試劑盒產品說明書規定的操作步驟基礎上通過2種不同的樣品前處理方式，分別在樣品提取前、凈化后進行改良，觀察膠體金卡實驗結果的呈現效果，以使基層快檢員在使用膠體金免疫層析法檢測氯霉素殘留的過程中能夠提高使用效果，對可能存在基質干擾樣品的檢測結果判讀更有把握。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器設備

氯霉素標準品(1mg·mL-1，北京曼哈格生物科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國霍尼韋爾B&J公司)；氯霉素殘留檢測試紙條(內含試劑及檢測卡，北京勤邦生物技術有限公司)。

搗樣機(JYL-C020E，九陽)；電子天平(AR323CN，奧豪斯儀器有限公司)；旋渦混合器(MS3 basic S025，德國IKA公司)；離心機(2-4，上海拖莫斯科學儀器有限公司)；樣品濃縮儀(Pro-12L，南京百思威科技發展有限公司)；單道手動可調移液器(20～200μL、1～5mL，芬蘭biohit實驗室儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 快檢試劑盒的選擇

本實驗所使用的快檢試劑盒氯霉素殘留檢測試紙條為廣東省市場監督管理局發布《食品快速檢測已評價產品目錄》中的合格快檢產品，產品標示檢出限0.1μg·kg-1。

1.3 2種前處理方式

原提取和脫脂提取。

1.4 實驗過程

1.4.1 樣品的選取及制備

本次實驗的樣品共3種，分別是牡蠣(生蠔)、鳙魚(大頭魚)、豬肉。獲取方式是在當地不同農貿市場所銷售的產品中進行隨機采購，采購數量要同時滿足快檢實驗及本次實驗需求。

每種樣品經過去頭、去皮、去內臟，取可食部位約100～150g，用搗樣機均勻絞碎，絞碎后的樣品冷凍保存備用。

1.4.2 提取

1.4.2.1 原提取

稱取1.4.1制備好的樣品2.00g(±0.01g)置于15mL離心管中，加入4mL提取劑(乙酸乙酯)；使用旋渦混合器渦動2min后，4000r·min-1離心5min。

1.4.2.2 脫脂提取

把1.4.1制備好的樣品放置玻璃燒杯中，加入石油醚，浸沒過杯中樣品高度，使用玻璃棒讓樣品與石油醚混勻反應；開啟水浴鍋，溫度調至60℃，把石油醚與樣品混勻后的樣品燒杯放在水浴鍋孔上，讓石油醚充分揮發。

1.4.3 濃縮

移取3mL上層有機相至10mL離心管中，再置于50～60℃的樣品濃縮儀通過氮氣流或空氣流下吹干。

1.4.4 復溶

向吹干的試管中依次加入0.2mL樣本復溶液(磷酸鹽緩沖液)，用旋渦混合器渦動2min充分混勻，使試管內壁上的殘留物溶解，靜置后待測。

1.4.5 測定

從原包裝中取出氯霉素快速檢測試紙條，吸取75μL樣品待測液于試紙條的加樣孔中，液體流動時開始計時，反應10min，根據結果示意圖進行判讀。從原包裝中取出的氯霉素快速檢測試紙條使用時應回溫至室溫，并在1h內使用。

1.4.6 判讀

通過對比試紙條的控制線(C線)和檢測線(T線)的顏色深淺進行結果判讀。由于長時間放置會引起檢測線顏色的變化，需在規定時間內進行結果判讀，結果判讀分3種情況。陰性(-)：檢測線(T線)顏色比控制線(C線)顏色深或者檢測線(T線)顏色與控制線(C線)顏色相當，表明樣品中氯霉素含量低于方法檢測限，見圖1。陽性(+)：檢測線(T線)不顯色或檢測線(T線)顏色比控制線(C線)顏色淺，表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測限，見圖2。無效：控制線(C線)不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效，見圖3。

圖1 陰性結果圖 圖2 陽性結果圖 圖3 無效結果圖

2 實驗結果

通過使用氯霉素快速檢測試紙條分別按照2種方法對本次3種基質的樣品分別完成了3組(每組4份)的快速檢測實驗，添加氯霉素標準品到各組分樣品中，添加濃度分別是0μg·kg-1、0.05μg·kg-1(0.5倍檢出水平)、0.1μg·kg-1(1.0倍檢出水平)，每個濃度做2個平行樣。具體結果見表1。

表1 實驗結果匯總

3 結論

3種基質的樣品使用原提取或脫脂提取進行前處理得出的實驗結果均能符合說明書的判定要求，通過添加對應濃度的標準物質得出的陰陽性實驗結果均能達到試劑盒標示的檢測水平要求。

原提取的樣品點板效果比經過脫脂提取后的樣品點板效果要好，具體體現：C/T線顏色較深，2條線對比較為明顯，易于結果判定；C/T線不易出現斷線情況，不容易影響結果判定；即使過了有效判定時間，結果也不會改變。

石油醚是低沸點烷烴組成的非極性有機溶劑，加入樣品后可以與動物中的脂肪酸互溶，石油醚沸點較低，容易揮發，故可以通過加入石油醚至樣品中進行脫脂。脫脂后的樣品再按照試劑盒說明書進行檢測，可以提高判定結果的準確度。