不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對牦牛瘤胃體外發酵的影響

夏洪澤, 黃文植, 張琳琳, 張曉涵, 崔占鴻, 劉書杰

(青海大學畜牧獸醫科學院， 青海省牦牛工程技術研究中心， 青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室， 西寧 810016)

21世紀初,盧德勛結合我國的飼草產量以及供給現狀，提出粗飼料分級指數(grading index，GI)概念，并將其引入飼草品質評價體系[1-2]。研究人員對GI模型進行了驗證、對比和改進，得出GI與飼料相對值(relative feed value，RFV)分級的順序性、準確性較為一致，表明GI可應用于飼糧中粗飼料組合的優化，作為評定粗飼料品質的依據[1-4]。研究表明，利用GI模型進行動物試驗，通過GI優化粗飼料組合的搭配，以達到同等條件下高精粗比飼糧營養調控作用，高GI條件下，干物質和中性洗滌纖維的表觀消化率較高，瘤胃降解纖維能力增強，乙酸較穩定，丙酸濃度升高，纖維含量越低或者蛋白含量越高，養分表觀消化率越高，GI值越高，粗飼料品質越好[2,5-7]。

牦牛作為青藏高原地區的特有畜種，主要以放牧形式養殖，但由于青藏地區冷季到來較早、時間相對較長，草地牧草產量相對較低，營養價值變化相對較大，由此，草畜沖突較為明顯，冷季反芻家畜自身的營養需要量難以得到滿足，致使家畜體況降低、甚至死亡[8-9]。近年，牦牛養殖已逐漸向適時適度規模舍飼轉型。在舍飼養殖過程中，燕麥干草作為優質禾本科牧草已被廣泛應用于牦牛生產。有報道指出，經典的粗飼料搭配為豆科牧草與禾本科牧草組合[10-13]。但將GI應用于牦牛粗飼料組合優化的研究尚未見報道，因此，本研究以青藏地區畜牧養殖中常用的燕麥干草、苜蓿干草為材料，將2種飼草按不同比例混合，結合GI體系，采用人工瘤胃法研究不同飼草組合在牦牛瘤胃中動態發酵規律，篩選出苜蓿干草-燕麥干草組合的最佳GI，充分發揮兩種飼草間的正組合效應，為提高粗飼料合理搭配、精飼料合理使用提供參考，為提高舍飼牦牛的生產性能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗地點位于青海大學畜牧獸醫科學院(E101°49′17″，N36°34′3″)，平均海拔2 261 m，屬大陸性高原半干旱氣候。其特點是：氣壓低、太陽輻射強，晝夜溫差大。苜蓿干草(alfalfa hay，AH)、燕麥干草(oat hay，OH)采集于湟中豐泰種養殖專業合作社，兩種牧草經鼓風干燥箱(65 ℃)干燥制成風干樣，剪短后粉碎，過 20目篩，密封保存待測。2種粗飼料原樣中粗蛋白質(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、代謝能(gross energy，GE)、鈣和磷含量詳見表1。本試驗的瘤胃液供體為3頭裝有瘤胃瘺管、體重(280.5±15.0)kg的大通牦牛，飼喂方式為自由采食、飲水，每日飼喂2次。飼喂日糧的成分和營養水平詳見表2。

表1 苜蓿干草和燕麥干草的營養水平(干物質基礎)Table 1 Nutrient levels of alfalfa hay and oat hay (dry material basis)

表2 日糧組成及其營養水平(干物質基礎)Table 2 Composition and nutrient levels of the diet (dry material basis)

1.2 試驗設計

將苜蓿干草與燕麥干草分別按照7∶3、6∶4、5∶5、4∶6和3∶7的質量比進行組合，參照胡紅蓮等[14]GI的計算方法，即制成GI為7.24、6.40、5.56、4.72、3.88的苜蓿干草-燕麥干草組合，分別進行牦牛瘤胃體外發酵試驗，設置發酵3、6、12、24和48 h，每個樣本設3個重復，且進行兩次重復試驗。

1.2.1樣本制備及瘤胃液的配置 稱取預制比例的苜蓿干草與燕麥干草組合樣品(400±5)mg裝入自制尼龍袋，待用。將裝好樣品的尼龍袋放入100 mL的發酵管內，為保證發酵管氣密性，在其內塞上均勻涂抹適量工業凡士林。每個樣本設3個重復，每次試驗設置3個空白對照。采用Menke等[15]的方法準備人工瘤胃營養液。于晨飼前，通過瘤胃瘺管，每頭牦牛各抽取1 000 mL瘤胃液，充分混勻。在通入CO2的前提下，將抽取的瘤胃液與人工瘤胃營養液以2∶1的體積比混合后，每個培養管加入(40.0±0.5)mL混合營養液。排空培養管內氣體，并記錄起始刻度值后，將培養管立即轉入已預熱的恒溫(39℃)自動震蕩的人工瘤胃裝置中進行培養。

1.2.2發酵底物、發酵液的收集 分別在發酵3、6、12、24 和48 h時停止培養，將培養管中裝有發酵底物的尼龍袋取出投入冰水中以終止反應，并用蒸餾水沖洗尼龍袋，直至無色后， 65 ℃烘干，備用；將發酵液收集于15 mL離心管，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 體外發酵指標測定

1.3.1累積產氣量(gas production，GP)及產氣參數的測定 參照夏洪澤等[16]方法測定累積產氣量(GP)的，分別在發酵0、3、6、12、24 和48 h取出培養管并記錄刻度值；利用 SAS 9.0 軟件，根據?rskov等[17]的產氣模型計算各處理體外產氣參數和累積產氣量。

GP=b(l-e-ct)

(1)

式中，b代表潛在產氣量(mL)；t代表發酵開始后某一時間(h)；c代表 b 的產氣速率常數(%·h-1)。

某一時間段累積產氣量(mL)=本時間段內累積產氣量-本時間段內空白管產氣量

(2)

1.3.2干物質降解率、中性洗滌纖維降解率及pH的測定 采用臺式酸度計(HANNA HI221型)測定發酵液pH。將發酵底物置于65 ℃烘箱中烘6 h，烘3次至恒重測定底物質量[18]，計算干物質降解率(dry matter disappearance in vitro，DMDIV)和中性洗滌纖維降解率(Neutral detergent fiber degradation in vitro，NDFDIV)。

干物質降解率=(底物質量-殘留底物質量) /底物質量×100%

(3)

中性洗滌纖維降解率=(底物NDF-殘留底物NDF)/底物NDF×100%

(4)

1.3.3氨態氮和微生物蛋白測定 通過比色法[19]利用紫外可見分光光度計(波長：625 nm)測定吸光值，通過標準曲線得出發酵液的氨態氮(ammonia nitrogen，NH3-N)濃度。微生物蛋白(microbial protein，MCP)的測定依據Cotta等[20]差速離心法，對菌體蛋白進行分離，將分離出的菌體蛋白轉移至消化管中，用考馬斯亮藍法進行測定。

1.3.4揮發性脂肪酸和甲烷的測定 揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)和甲烷(CH4)的測定采用氣相色譜儀(日本島津 GC-2014)進行測定[21-22]。其中，VFAs測定的氣相色譜條件為：載氣N2，分流比40∶1，進樣量1 μL，進樣孔溫度250 ℃，輔助箱溫度250 ℃，氣化室溫度250 ℃，FID檢測器溫度250 ℃，色譜柱型號為AT-FFAP 毛細管填充柱(30.0 m×0.32 μm)。恒流模式：流量 2.1 mL·min-1，平均線速度 38 cm·s-1，柱壓 11.3 psi(0.1 Mpa)。柱溫箱程序：10 ℃·min-1升溫至90 ℃，1 min；10 ℃·min-1升溫至120℃，1 min；10 ℃·min-1升溫至150 ℃，3 min。CH4測定的氣相色譜條件為：載氣N2(40 mL ·min-1)，進樣量100 μL，進樣口溫度60 ℃，柱溫50 ℃，TCD 檢測器溫度100 ℃，熱絲溫度150 ℃。甲烷計算公式如下。

甲烷產量(mL)=總產氣量×甲烷所占百分比

(5)

1.3.5組合效應指數的計算 單項組合效應值(single actors associative effects index，SFAEI)和綜合組合效應指數(multiply factors associative effects index，MFAEI)的計算參照王旭等[1]方法。

SFAEI= [組合后某參數實測值-(組分一實測值×其所占比例+組分二實測值×其所占比例)]/ (組分一實測值×其所占比例+組分二實測值×其所占比例)

(6)

MFAEI=∑SFAEI

(7)

1.4 數據處理與分析

利用Excel 2016進行數據的整理和分析，采用SPSS 20.0軟件進行單因素ANOVA分析，采用 Duncan 氏 SSR法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對累積產氣量的影響

各GI組合的GP隨著培養時間延長而增加；各時間段的GP和潛在產氣量(b)隨著GI降低呈先升高后降低的趨勢，且GI=6.40組合的產氣量高于其他GI組合(表3)。發酵3、6和12 h，GI=6.40組合與GI=7.24組合間累積產氣量差異不顯著，但均顯著高于其他組合；發酵24 和48 h，GI=6.40組合的產氣量顯著高于其他組合。

表3 各時間段不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的累積產氣量Table 3 GP of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time

2.2 不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對干物質降解率、中性洗滌纖維降解率的影響

發酵3～12 h，DMDIV隨著GI降低呈減小趨勢；發酵24和48 h，DMDIV隨著GI減小呈先增加后降低的趨勢，且在GI=6.40時達到最大值(表4)。發酵3 h，GI=6.40組合DMDIV最高，與GI=7.24、5.56組合間差異不顯著，但顯著高于GI=4.72、3.88組合。發酵12 h，GI=7.24組合DMDIV最高，與GI=6.40、5.56組合間差異不顯著，但顯著高于GI=4.72、3.88組合。發酵24 h，GI=6.40組合與GI=7.24組合的DMDIV差異不顯著，但顯著高于其他組合。發酵48 h，GI=6.40組合與GI=7.24、5.56、4.72組合的DMDIV差異不顯著，但顯著高于GI=3.88組合。

表4 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的干物質降解率Table 4 DMDIV of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (%)

NDFDIV隨著GI降低呈先升高后降低的趨勢，但 GI=6.40組合的NDFDIV均高于其他GI組合(表5)。發酵3 h，GI=6.40組合的NDFDIV與GI=7.24、5.56、4.72組合間差異不顯著，但顯著高于GI=3.88組合。發酵6 h，GI=6.40組合的NDFDIV與GI=7.24、5.56組合間差異不顯著，但顯著高于GI=4.72、3.88組合。發酵48 h，GI=6.40組合的NDFDIV與GI=7.24、5.56、4.72組合間差異不顯著，但顯著高于GI=3.88組合。

表5 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的中性洗滌纖維降解率Table 5 NDFDIV of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (%)

2.3 不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對發酵液氨態氮、微生物蛋白和pH的影響

各時間段的NH3-N濃度均隨著GI減小呈先增加后降低的趨勢(表6)。發酵3～12 h，GI=6.40組合的NH3-N濃度與GI=5.56組合差異不顯著，但顯著高于其他組合。發酵24 h，GI=6.40組合的NH3-N濃度最高，顯著高于其他GI組合。發酵48 h，GI=6.40組合的NH3-N濃度與GI=7.24組合間差異不顯著，但顯著高于其他GI組合。

各時間段的MCP濃度隨著GI降低呈現出先增加后降低的趨勢，且在GI=6.40時達到最大值(表7)。發酵3 h，GI=6.40組合與GI=7.24組合的MCP濃度較高，且兩者間無顯著差異，但均顯著高于其他組合。發酵6 h，GI=6.40組合與GI=7.24、5.56組合的MCP濃度差異不顯著，但顯著高于GI=4.72、3.88組合。發酵12和24 h，GI=6.40組合與GI=7.24、5.56、4.72組合的MCP濃度差異不顯著，但顯著高于GI=3.88組合。發酵48 h，GI=6.40組合與GI=7.24組合的MCP濃度差異不顯著，但顯著高于GI=5.56、4.72、3.88組合。

表7 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的MCP濃度Table 7 MCP concentration different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mg·L-1)

各時間段發酵液pH隨著GI降低呈上升趨勢(表8)。發酵3～6 h，GI=6.43組合的pH與GI=7.24、5.56、4.72組合差異不顯著，但均顯著低于GI=3.88的組合。發酵12～24 h，各組合發酵液的pH均無顯著差異。發酵48 h，GI=6.40組合的pH與GI=7.24、5.56組合間差異不顯著，但均顯著低于GI=4.72、3.88組合。

表8 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的pH Table 8 pH of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time

2.4 各時間段不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對發酵液中揮發性脂肪酸含量的影響

隨著GI減小，不同發酵時長發酵液中乙酸濃度均呈現出先升高后降低趨勢，且GI=6.40組合的乙酸濃度最高(表9)。發酵3～6 h，GI=6.40組合的乙酸濃度顯著高于其他GI組合。發酵12～48 h，各組合發酵液的乙酸濃度均無顯著差異。

表9 不同燕麥干草-苜蓿干草組合的乙酸濃度Table 9 Acetic acid of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mmol·L-1)

隨著GI減小，不同發酵時長的發酵液中丙酸濃度均呈現出先增加后降低的趨勢，且GI=6.40組合的丙酸濃度最高(表10)。發酵3 和12 h，GI=6.40組合的丙酸濃度顯著高于其他GI組合。發酵6 和48 h，GI=6.40組合的丙酸濃度與GI=7.24、5.56組合間差異不顯著，但顯著高于GI=4.72、3.88組合。

表10 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的丙酸濃度Table 10 Propionic acid of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mmol·L-1)

隨著GI減小，不同發酵時長的發酵液中總揮發性脂肪酸濃度呈先升高后降低的趨勢，且GI=6.40組合的總揮發性脂肪酸濃度最高(表11)。發酵3 h，GI=6.40組合的總揮發性脂肪酸濃度顯著高于其他GI組合。發酵6 h，GI=6.40組合的總揮發性脂肪酸濃度與GI=7.24組合差異不顯著，但顯著高于其他GI的組合。發酵12～48 h，GI=6.40組合的總揮發性脂肪酸濃度與GI=7.24、5.56組合差異不顯著，但顯著高于其他GI組合。

表11 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的總揮發性脂肪酸濃度Table 11 Total VFAs of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mmol·L-1)

2.5 不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對甲烷產量的影響

CH4含量隨著GI減小呈現出先升高后降低的趨勢，且GI=6.40組合的CH4含量最高(表12)。發酵3 h，GI=6.40組合的CH4含量顯著高于其他組合。發酵6和12 h，不同GI組合的CH4含量均無顯著差異。發酵24 和48 h，GI=6.40組合的CH4含量與GI=7.24、5.56、4.72組合差異不顯著，但均顯著高于GI=3.88組合。

表12 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的甲烷產量Table 12 CH4 of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mL·mg-1)

2.6 不同分級指數燕麥干草-苜蓿干草組合對綜合組合效應指數的影響

發酵3～48 h，MFAEI均隨著GI降低呈現出先增大后減小的趨勢，且GI=6.40組合的MFAEI均高于其他GI組合(表13)。其中，GI=7.24組合在發酵24和48 h時產生了正組合效應；GI=6.40、5.56組合在發酵3～48 h時均產生了正組合效應；GI=4.72組合在發酵24和48 h時產生了正組合效應；GI=3.88組合在發酵3～48 h時均為負組合效應。

表13 不同GI燕麥干草-苜蓿干草組合的綜合組合效應指數 Table 13 MFAEI of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time

3 討論

產氣量作為一個綜合反映底物發酵程度的重要指標，同時也表現出了瘤胃微生物的活躍程度。產氣量的多少反映了燕麥干草-苜蓿干草組合的可消化性[16]。本研究中不同GI組合的GP均隨培養時間延長而增加，說明體外發酵處于正常狀態。GP與DMDIV呈正相關，且不同發酵時長的GP、潛在產氣量、DMDIV、NDFDIV均隨著GI減小呈現先升高后降低的趨勢，說明通過苜蓿干草與燕麥干草組合，高蛋白質的苜蓿干草可顯著改善燕麥干草的發酵程度，促進纖維物質的消化，但GI=7.24組合的DMDIV、NDFDIV低于GI=6.40組合，說明苜蓿干草雖能提高燕麥干草的消化率但也有限度，這與Silva等[23]研究結果一致。

本研究發現，CH4占總產氣量的比例相對穩定，氣體中各成分含量相對降低，但氣體占總產氣量的相對比例變化較小，這與Nagaraja等[24]研究結果相一致。馮仰廉等[25]指出瘤胃發酵中性洗滌纖維對甲烷影響較大。而本研究中不同GI組合日糧的 NDFDIV與甲烷產量趨勢較為一致，這可能是由于不同GI組合的中性洗滌纖維含量不同，對產甲烷菌的生長繁殖有一定影響。因此，GI=6.40粗飼料組合的甲烷產量最高，也可能是其中的纖維在瘤胃內降解加快，導致甲烷產量增多，這一結果與王增林等[26]和鄭文思等[27]結論相似。

MCP 可為反芻動物瘤胃氮的主要來源，且NH3-N濃度又是影響MCP合成的重要因素。若NH3-N濃度過高會浪費營養源，過低會降低瘤胃微生物活性[28-29]。前人研究表明，MCP合成所需的NH3-N濃度為3.5～290 mg·L-1[30-32]。本研究中各GI指數組合的NH3-N濃度均在105.9～262.0 mg·L-1，可為微生物提供充足氮源以合成MCP。20～50 mg·L-1就可滿足細菌對纖維降解的需求，GI=6.40組合的NH3-N和MCP濃度均最高，且中性洗滌纖維降解率也高于其他組合，可能是由于GI=6.40組合給予了瘤胃微生物更加適合的生長環境，因此，對飼料組合的降解也更加充分，從而使這一組合的NH3-N、MCP濃度均高于其他組合。

pH高低是牦牛瘤胃發酵功能、內環境穩態、有機酸生成以及微生物活性的最直接表現[33]。研究顯示，反芻動物瘤胃液pH正常變動范圍為6.0～7.5[34-36]。本研究各GI組合的pH均在正常范圍內，且pH與VFAs濃度呈負相關。其中GI=6.40組合的pH低于其他組合，可能是由于底物發酵充分，VFAs產量高，從而導致pH較低。VFAs可為機體提供大量的能量[37-38]，其中乙酸、丙酸和丁酸占VFAs含量的95%左右，且乙酸約占VFAs產量的70%～75%[39-40]。VFAs不僅是反芻動物能量代謝的表現形式，還具有許多調節功能，如乙酸有利于提高動物的體脂率，丙酸有利于葡萄糖的轉化和儲存[41]。本研究中，乙酸、丙酸等VFAs濃度隨著GI減小呈先增加后減小的趨勢，可能是由于發酵底物中的燕麥干草富含纖維素，隨著GI指數的改變，燕麥干草比例增加，纖維素含量增加，微生物可利用的纖維素增多，產生的揮發性脂肪酸增多，與前人研究結果相一致[42-44]。當燕麥干草達到一定量時，繼續增加則不利于瘤胃發酵，與李明超[45]研究結果一致。由此表明，通過粗飼料合理搭配有利于提高粗飼料中干物質的降解率，提高利用率。

王旭[1]以GI和MFAEI為依據，對不同種類飼草進行配比組合，最大程度地發揮粗飼料間的正組合效應，從而降低精料的比例，既保證了動物的生產性能，又提高了養殖效益。張吉鹍[46]研究表明，牧草比例不同，營養組成不同，進而影響了整體發酵程度，改變了飼料的利用率。因此，本研究也利用 MFAEI參數，將各項指標綜合起來，研究燕麥干草和苜蓿干草不同配比的組合效應，各GI組合的MFAEI隨著發酵時間的延長逐漸增大；且隨著GI的減小呈現出先增大后減小的趨勢，即隨著苜蓿干草比例的減少，MFAEI先升高后降低。由此表明，苜蓿干草和燕麥干草組合可以產生組合效應，但需比例適當，若燕麥干草比例過高會使組合的可發酵程度降低，MFAEI隨之減小，直至產生負組合效應。