芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞EMT的影響

徐愛萍，林 華，高麗輝，李 玲，陳夢威，王 歌，楊 娟，牛艷芬

（昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，云南 昆明 650500）

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是慢性腎臟疾病進展至終末期腎病的必經過程[1]，RIF的主要病理特征為大量細胞外基質成分（extracellular matrix，ECM）如纖連蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ）等在腎間質沉積并形成瘢痕，從而破壞腎臟結構，導致腎功能受損[2-3]。

在腎臟損傷過程中，多種因子（如TGF-β1）可誘導腎小管上皮細胞轉化為成纖維細胞/肌成纖維細胞，并導致ECM蛋白沉積的過程被稱為上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。大量研究表明，EMT是RIF的發生和發展中重要的病理生理過程，是啟動和維持RIF的關鍵機制[4-5]。芒果苷元（norathyriol，NL）屬于雙苯并吡喃酮類黃酮化合物，本課題組前期研究發現芒果苷元能降低血尿酸水平且改善動物腎功能，已經申請國家發明專利（申請號：201610181082.3），尤其是對腎小管具有很好的保護作用。本研究擬采用TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞（HK-2）成EMT模型，以苯溴馬隆作為陽性對照，觀察芒果苷元對HK-2細胞EMT的影響，為芒果苷元腎保護作用的后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞（HK-2），購自中科院上海細胞庫；芒果苷元，昆明制藥集團股份有限公司；苯溴馬隆，阿拉丁；人重組TGF-β1，Peprotech；MTT，Amresco公司；DMEM干粉培養基，Gibico；DMSO，Biofroxx；胎牛血清，Gibico；胰蛋白酶干粉，Amresco公司；Transwell小室，Corning；結晶紫，Meilunbio；兔抗Fibronectin抗體，萬類生物；兔抗ColⅠ抗體，萬類生物；山羊抗兔IgG/辣根酶標記，中山金橋。

1.2 儀器

二氧化碳培養箱為Thermo產品，型號heracell 150i；倒置顯微鏡為Olympus產品，型號CKX41；全波長紫外-可見光酶標儀為美國Biotek產品，型號Synergy2；高壓鍋為上海申安醫療器械廠產品，型號LDZX-50KBS；恒溫搖床為博彩產品。型號THZ-032；超低溫冰箱為美國Thermo Electron公司產品，型號Forma-86 C991。

1.3 方法

細胞培養：人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱內孵育培養，隔2 d換液。

MTT法檢測芒果苷元對HK-2細胞活力的影響：選生長狀態良好的HK-2細胞，待其生長達70%～80%融合時，按5×103個/孔接種于96孔細胞培養板，37 ℃，5% CO2培養箱中孵育培養。待細胞貼壁后，加入無FBS的DMEM培養基饑餓細胞過夜，使細胞同步化于G0期。給以芒果苷元（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）和苯溴馬隆（10-7mol/L）干預48 h，48 h后，每孔加20 μL MTT，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min，492 nm 波長下測定OD值，計算細胞活力。細胞相對活力（%）=（處理孔OD492/正常對照孔OD492）×100[6]。

劃痕實驗檢測細胞遷移能力：選生長狀態良好的HK-2細胞，待其生長達70%～80%融合時，接種至六孔板（種板前用marker筆在六孔板背后均勻的劃橫線，大約每隔0.5 cm一道，使每孔至少有五條線穿過，便于后續拍照時定位），將細胞分為正常組、模型組（TGF-β1誘導組）、芒果苷元10-8、10-7、10-6mol/L組和苯溴馬隆10-7mol/L組。37 ℃，5% CO2培養箱內孵育培養細胞，待其貼壁后，將含10% FBS的培養基換成無FBS培養基，使細胞同步化于G0期。加入各濃度芒果苷元（10-8、10-7、10-6mol/L）和苯溴馬隆（10-7mol/L），培養箱孵育培養4 h，4 h后用200 μL槍頭垂直于marker筆所劃橫線劃痕，每孔劃5條，PBS洗滌3次，重新加入系列濃度芒果苷元和苯溴馬隆，同時給以10 ng/mL的TGF-β1誘導，在TGFβ1誘導后第0 h和24 h時，每孔選取六個點拍照，計算24 h遷移率。遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-測定時劃痕寬度）/ 0 h劃痕寬度× 100%[6]。

Transwell法檢測細胞侵襲能力：用無FBS培養基稀釋Matrige，鋪于24孔Transwell小室的上室，放入37 ℃培養箱，待Matrigel凝固后，小心吸走上室液體，細胞消化后用無FBS培養基重懸并計數，每孔5×104個細胞，接種于上室，下室加入含10% FBS的培養基，37 ℃，5% CO2培養24 h，吸棄上室培養基，用棉簽輕輕擦去上室細胞，并用PBS洗滌2次，甲醇在室溫固定20 min，再用PBS洗2次，結晶紫室溫染色20 min，PBS洗3次，100×倒置顯微鏡下選4個視野拍照，計數穿過上室的細胞數。

Western bolt免疫印跡實驗：細胞培養48 h后，用PBS洗滌細胞3次，加入含有蛋白酶抑制劑、PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解細胞，用細胞刮刀將細胞刮下并收集至EP管，離心后取上清，將收集好的蛋白樣品定量，加5×loading buffer，100 ℃變性，在壓縮膠（60 V，30 min），分離膠（110 V，80 min）條件下，進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，260 mA，90 min，冰水浴條件下轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用5%脫脂牛奶稀釋一抗至適當濃度，4 ℃ 封閉過夜，次日洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵2 h，洗膜，BIO-RAD化學發光成像儀進行成像，采用Image j分析軟件對條帶進行分析，求出各條帶的光密度值。

1.4 統計學處理

用Graphpad prsim5.0軟件進行統計學分析，所有實驗數據用均數±標準差（）表示，用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用Dunnett法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芒果苷元對HK-2細胞活力的影響

圖1所示，與正常組相比，芒果苷元各濃度組及苯溴馬隆組對HK-2細胞活力無明顯影響（P＞0.05）。

圖1 芒果苷元對HK-2細胞活力的影響（，n=3）Fig.1 Effect of norathyriol on HK-2 cell viability

2.2 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞表型轉化的影響

如圖2所示，在倒置顯微鏡下（40×），正常的HK-2細胞為鵝卵石狀、鋪路石狀、圓形或者橢圓形，細胞與細胞之間連接緊密，TGF-β1作用24 h后，模型組細胞變長，細胞之間連接松散，變為長梭形；在給以芒果苷元10-8、10-7、10-6mol/L和苯溴馬隆（10-7mol/L）干預之后，與模型組相比，橢圓形細胞增多。

圖2 芒果苷元對TGF-β1 誘導24 h后的HK-2細胞形態變化的影響（40×）Fig.2 Effect of norathyriol on the morphological changes of HK-2 cells induced by TGF-β 1 for 24 h（40×）

2.3 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞遷移能力的影響

與正常組比，TGF-β1誘導HK-2細胞24 h后，模型組遷移率顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05，0.01）；與模型組相比，芒果苷元10-8，10-7，10-6mol/L組及苯溴馬隆組遷移率顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，0.01），見圖3、圖4。

圖3 芒果苷元對TGF-β1誘導后HK-2細胞遷移率的影響（40×）Fig.3 Effect of norathyriol on the migration of HK-2 cells induced by TGF-β 1（40×）

圖4 芒果苷元對TGF-β1誘導后的HK-2細胞的遷移率的影響（，n=3）Fig.4 Effect of norathyriol on the migration of HK-2 cells induced by TGF-β1（，n=3）

2.4 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞侵襲能力的影響

TGF-β1（10 ng/mL）誘導HK-2細胞后，與正常組比，模型組侵襲能力顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，芒果苷元10-6mol/L組細胞侵襲能力顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與苯溴馬隆組相比，等濃度芒果苷元（10-7mol/L）組侵襲率無明顯變化（P＞0.05），如圖5，圖6。

圖5 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞侵襲能力的影響（100×）Fig.5 Effect of norathyriol on invasion of HK-2 cells induced by TGF-β 1（100 ×）

圖6 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞侵襲能力的影響（，n=3）Fig.6 Effect of norathyriol on invasion of HK-2 cells induced by TGF-β 1（，n=3）

2.5 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞ColⅠ和FN蛋白表達水平的影響

2.5.1 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞ColⅠ蛋白表達水平的影響與正常組相比，模型組細胞ColⅠ表達顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，芒果苷元10-6mol/L組和苯溴馬隆組細胞ColⅠ表達顯著下調，差異具有統計學意義（P＜0.05，0.01），見圖7。

圖7 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞ColⅠ蛋白表達水平的影響（，n=3）Fig.7 Effect of norathyriol on expression of colIprotein in HK-2 cells induced by TGF-β1（，n=3）

2.5.2 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞FN蛋白表達水平的影響與正常組相比，模型組細胞FN蛋白表達顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，芒果苷元10-6mol/L組細胞FN蛋白表達顯著下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖8。

圖8 芒果苷元對TGF-β1誘導的HK-2細胞FN表達水平的影響（，n=3）Fig.8 Effect of norathyriol on expression of FN protein in HK-2 cells induced by TGF-β1（，n=3）

3 討論

TGF-β1是公認的最強的纖維化誘導因子，在體外可誘導多種上皮細胞發生EMT。在RIF過程中，TGF-β1可刺激腎小管上皮細胞發生EMT，促進RIF的發生發展[7-8]。本實驗參照文獻[9-11]，給以10 ng/mL TGF-β1誘導HK-2細胞，復制腎小管上皮細胞EMT模型，在此模型上研究芒果苷元對EMT的作用及其機制。

正常HK-2細胞呈鋪路石形，細胞與細胞之間緊密連接，在發生EMT時細胞形態會發生改變，可由原來的圓形或橢圓形變成長梭形，且細胞與細胞間的間距變大，細胞形態和細胞間間距的改變可反映腎小管上皮細胞EMT的程度[12]，本實驗給以TGF-β1誘導HK-2細胞24 h時后拍照，觀察細胞形態的變化，發現在TGF-β1誘導后24 h時，模型組細胞發生明顯的表型轉化，細胞由鵝卵石形態轉化為長梭形，提示HK-2細胞發生EMT；在給以芒果苷元干預后，部分HK-2細胞能維持鋪路石形態，提示芒果苷元能抑制TGFβ1誘導的HK-2細胞形態的變化。

正常腎小管上皮細胞最顯著的特征是具有端-基極性且細胞與細胞間保持緊密的連接，他們緊密的排列并粘附于腎小管基底膜上形成單層結構，因此幾乎沒有運動能力，而成纖維細胞沒有粘附到任何膜上，沒有細胞極性，也不會形成單層結構，能夠自由的移動。在外界誘導因素刺激下，發生EMT的腎小管上皮細胞轉化為間充質成纖維細胞，獲得遷移和侵襲能力，穿過腎小管基底膜，轉化為能分泌大量ECM的肌成纖維細胞，參與RIF進程[12]，因此遷移和侵襲能力可間接反映細胞EMT的程度。本實驗用劃痕實驗法檢測TGFβ1誘導24 h后HK-2細胞的遷移能力，實驗結果表明，在TGF-β1誘導24 h后，模型組HK-2細胞遷移率顯著升高，說明腎小管上皮細胞發生轉分化，符合EMT模型特征。給以芒果苷元后，HK-2細胞遷移率有不同程度的下降，提示芒果苷元能抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞的遷移，抑制EMT的進程。Transwell法可用于檢測細胞侵襲能力，將細胞接種于預先鋪好Matrigel的上室，培養24 h，再將穿膜細胞進行計數來評估細胞的侵襲能力，本實驗中，模型組HK-2細胞穿膜數顯著增多，提示TGF-β1誘導后細胞獲得侵襲能力，能夠穿過Matrigel，給以芒果苷元后，HK-2細胞侵襲能力顯著下降，提示芒果苷元能降低由TGF-β1誘導的細胞侵襲，抑制EMT的發展。

RIF的主要特征即為ECM在腎間質的積聚，腎臟ECM成分主要來源于活化的間質成纖維細胞和肌成纖維細胞，肌成纖維細胞可由多種細胞轉化而來，其中腎小管上皮細胞是肌成纖維細胞的重要來源之一，有研究表明肌成纖維細胞分泌ECM的能力是成纖維細胞的4～5倍，表明腎小管上皮細胞EMT在RIF發生發展過程中具有重要作用。腎臟ECM成分主要包括膠原，糖蛋白以及蛋白聚糖三類物質，在正常生理條件下，腎小管上皮細胞即可產生少量ECM成分，用于形成腎小管基底膜以及維持腎臟生理結構，FN屬于糖蛋白類ECM，FN在生理狀態下少量表達參與腎小管基底膜的形成，而在外界刺激發生EMT時，FN的沉積最早出現并持續增加，FN的表達水平可用來評判纖維化程度，而膠原成分中的ColⅠ常常被認為可以引發腎臟纖維化，ColⅠ的高表達與腎臟纖維化的發生密切相關[12-14]。本實驗中，TGFβ1誘導HK-2細胞48 h后，模型組HK-2細胞中FN和ColⅠ蛋白表達水平顯著上調，給以芒果苷元后，蛋白表達均顯著下調，提示芒果苷元可降低FN、ColⅠ等ECM成分延緩EMT。