低強(qiáng)度聚焦超聲刺激小鼠伏隔核的有效性

蘭云艷，馮煜然，鄭 宇，楊振東，趙 詣，朱 梅

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，云南 昆明 650032）

近年來，神經(jīng)調(diào)控技術(shù)逐漸發(fā)展為神經(jīng)機(jī)制科學(xué)研究的重要工具，也在腦功能疾病的治療方面有著新興的發(fā)展：腦深部刺激（deep brain stimulation，DBS）、迷 走 神 經(jīng) 刺 激（vagus nerve stimulation，VNS）、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（repeated transcranial magnetic stimulation，rTMS）等神經(jīng)調(diào)控技術(shù)已被美國食品和藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)治療帕金森病、肌張力障礙、強(qiáng)迫癥、癲癇和抑郁癥等疾病[1]。以上常用的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)能有效促進(jìn)或抑制腦功能疾病患者的大腦認(rèn)知功能，然而均受到了空間聚焦能力以及操作創(chuàng)傷性的限制。超聲神經(jīng)刺激可以無創(chuàng)經(jīng)顱靶向特定的大腦區(qū)域并調(diào)節(jié)特定的神經(jīng)通路或神經(jīng)元，神經(jīng)調(diào)控常運用低強(qiáng)度聚焦超聲（low-intensity focused ultrasound，LIFU）進(jìn)行刺激。LIFU結(jié)合了操作無創(chuàng)性、空間分辨率高以及靶點控制便捷等特性，在腦科學(xué)領(lǐng)域擁有美好的發(fā)展前景。伏隔核（nucleus accumbens，NAc）是中腦邊緣獎賞環(huán)路的關(guān)鍵節(jié)點，常作為干預(yù)包括成癮在內(nèi)的各種精神障礙的靶點[2]。目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于LIFU調(diào)控NAc的實驗研究。本研究旨在通過對小鼠的NAc腦區(qū)進(jìn)行超聲刺激，觀察小鼠行為學(xué)的改變、NAc超微結(jié)構(gòu)的改變及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，初步探討超聲神經(jīng)刺激的作用機(jī)制，為腦科學(xué)的新興治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組C57BL/6小鼠，雄性，6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g，共100只，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（湘）2019-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將其隨機(jī)分為實驗組和對照組各50只，待超聲刺激及假刺激后，2個大組內(nèi)又隨機(jī)分為行為學(xué)評估30只（分別進(jìn)行強(qiáng)迫游泳、曠場和水迷宮實驗）、電鏡檢測10只和神經(jīng)遞質(zhì)檢測10只，立刻進(jìn)行相關(guān)檢測。實驗動物的處理方法均經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會審核批準(zhǔn)。以上實驗分批次進(jìn)行，各批次間開始超聲刺激的時間、超聲刺激參數(shù)等嚴(yán)格控制不變。

1.1.2 試劑與儀器多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）ELISA試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；；強(qiáng)迫游泳、曠場實驗、Morris水迷宮、腦立體定位儀、小動物麻醉機(jī)（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；超聲神經(jīng)刺激儀（中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院）；全自動樣品快速研磨機(jī)（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研中心實驗室提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲刺激濃度為1.5%的異氟烷麻醉小鼠，將小鼠固定于腦立體定位儀上，根據(jù)小鼠腦圖譜找到NAc所在位置（以Bregma為坐標(biāo)原點，X軸±0.05 cm，Y軸+0.12 cm），見圖1。超聲神經(jīng)刺激儀進(jìn)行超聲輻照，探頭頻率0.5 MHz，脈沖重復(fù)頻率（Pulse repetition frequency，PRF）1 000 Hz，脈沖聲壓590 kPa，脈沖時間0.5 ms，脈沖周期1 ms，刺激時間300 ms，刺激間隔3 s，刺激總時間10 min，每日2次，持續(xù)7 d。對照組以同樣的方式操作，不開啟設(shè)備。

圖1 LIFU刺激小鼠NAc圖Fig.1 Image of NAC stimulated by LIFU

1.2.2 行為學(xué)評價（1）強(qiáng)迫游泳：小鼠被放入裝有水的圓柱形透明水缸中，讓小鼠強(qiáng)迫游泳6 min，視頻攝像觀察第2～6 min時間內(nèi)小鼠漂浮不動的時間。

（2）曠場實驗：實驗裝置為由木板制成的無蓋方箱，檢測時將小鼠逐只放置在方箱中央，攝像記錄小鼠在5 min內(nèi)的行為和活動情況。檢測指標(biāo)包括：小鼠在曠場內(nèi)行進(jìn)總距離、行進(jìn)平均速度、中心區(qū)活動距離、中心區(qū)停留時間以及中心區(qū)穿越次數(shù)。

（3）Morris水迷宮：Morris水迷宮通過等距的邊緣和方向?qū)⑺貏澐譃樗膫€象限。第一象限為目標(biāo)象限，平臺放至第一象限。測試前一天將每組小鼠放在平臺上15 s以適應(yīng)環(huán)境，并讓它們自由游泳1 min。1～6 d進(jìn)行空間導(dǎo)航實驗，每組小鼠在平臺上放置15 s，后按四個象限順序依次放入水中，小鼠登上平臺并停留5 s視為上臺成功，最長測試時間為60 s。如果小鼠在60 s后仍未登上平臺，則引導(dǎo)其至平臺停留10 s以強(qiáng)化記憶。第7 d撤去平臺，將小鼠由目標(biāo)象限的對位象限（即第三象限）放入水中，進(jìn)行60 s的空間探索實驗。以定位航行實驗?zāi)繕?biāo)象限的對面象限（即第三象限）為入水點的逃避潛伏時間（小鼠登上平臺所用的時間）、跨越平臺的次數(shù)和目標(biāo)象限的停留時間為檢測指標(biāo)評價小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.3 神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察超聲干預(yù)結(jié)束后，8%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，開胸暴露心臟，在右心耳開一小口，于心尖（左心室）快速灌注預(yù)冷的生理鹽水，直至灌注液接近無色，換用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，灌注結(jié)束后于冰上迅速取腦，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗殘留血液，濾紙拭干后，參照小鼠腦圖譜迅速分離NAc至1 mm3，置于含3%戊二醛的1.5 mL EP管中，4 ℃保存待送電鏡室。

1.2.4 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定超聲干預(yù)結(jié)束后，8%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，斷頭處死，于冰上迅速分離腦組織，取NAc，用預(yù)冷的PBS沖洗殘留血液，稱重后剪碎。按1 g∶9 mL的重量體積比往剪碎的NAc組織中加入對應(yīng)體積的PBS，后于高通量研磨儀中充分研磨。最后將勻漿液于5 000×g離心10 min，取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料用表示，2組間差異用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果比較

如表1所示，在強(qiáng)迫游泳實驗中，超聲刺激組小鼠在水中漂浮不動的時間為46.29 s，明顯長于對照組的16.67 s（P＜0.001），表明超聲刺激組小鼠在無可逃避的壓迫環(huán)境中興奮性降低，表現(xiàn)出絕望不動的狀態(tài)，在生理和心理上均表現(xiàn)出類似抑郁的癥狀。

表1 LIFU對小鼠強(qiáng)迫游泳實驗漂浮不動時間的影響（）Tab.1 Effect of LIFU on floating immobility time of mice in forced swimming experiment（）

表1 LIFU對小鼠強(qiáng)迫游泳實驗漂浮不動時間的影響（）Tab.1 Effect of LIFU on floating immobility time of mice in forced swimming experiment（）

與對照組比較，***P＜0.001。

2.2 2組小鼠曠場實驗結(jié)果比較

如表2所示，曠場實驗中，超聲刺激組小鼠較對照組在曠場中行進(jìn)總距離、行進(jìn)平均速度、中央?yún)^(qū)活動距離、中央?yún)^(qū)停留時間和中央?yún)^(qū)穿越次數(shù)均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），表明超聲刺激組小鼠在面對空曠陌生的環(huán)境時表現(xiàn)出探究欲望減少、自主活動減少等類似焦慮的行為狀態(tài)。

表2 LIFU對小鼠曠場實驗各項指標(biāo)的影響（）Tab.2 Effects of LIFU on various indicators of open field experiment in mice（）

表2 LIFU對小鼠曠場實驗各項指標(biāo)的影響（）Tab.2 Effects of LIFU on various indicators of open field experiment in mice（）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 2組小鼠水迷宮實驗結(jié)果比較

如表3所示，水迷宮實驗中，超聲刺激組小鼠較對照組逃避潛伏時間明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，在目標(biāo)象限停留時間明顯縮短（P＜0.05，P＜0.01）。如圖2所示，超聲刺激組小鼠較對照組游泳距離明顯較長，且在目標(biāo)象限活動的路程明顯較短，表明超聲刺激組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減弱。

圖2 2組小鼠的游泳路徑圖Fig.2 Swimming paths of the two groups of mice

表3 LIFU對小鼠水迷宮實驗各項指標(biāo)的影響（）Tab.3 Effects of LIFU on various indicators of water maze experiment in mice（）

表3 LIFU對小鼠水迷宮實驗各項指標(biāo)的影響（）Tab.3 Effects of LIFU on various indicators of water maze experiment in mice（）

與對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.4 2組小鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變

對照組神經(jīng)元核大、圓，核仁多，染色質(zhì)多，核膜清晰（圖3A），胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等結(jié)構(gòu)清晰正常，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，可見較清晰的內(nèi)嵴與膜（圖3B）。超聲刺激組神經(jīng)元腫脹、變性甚至壞死，細(xì)胞核變小、溶解、固縮，染色質(zhì)減少，核質(zhì)界限不清（圖3C），胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體內(nèi)嵴排列紊亂或消失，呈空泡狀（圖3D）。

圖3 小鼠伏隔核神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of mouse nucleus accumbens neurons

2.5 2組小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定結(jié)果

如表4所示，超聲刺激組與對照組比較，小鼠NAc單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT的含量均明顯降低（P＜0.000 1），表明超聲刺激一定程度上降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。

表4 LIFU對小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響（）Tab.4 Effects of LIFU on monoamine neurotransmitters in mice（）

表4 LIFU對小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響（）Tab.4 Effects of LIFU on monoamine neurotransmitters in mice（）

與對照組比較，**P＜0.000 1。

3 討論

LIFU通過超聲換能器提供可精確調(diào)控的超聲波（機(jī)械波），作用于指定腦區(qū)，實現(xiàn)對該部位神經(jīng)核團(tuán)的精準(zhǔn)刺激，誘發(fā)其神經(jīng)活動和功能狀態(tài)的改變，從而在宏觀上實現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路和功能網(wǎng)絡(luò)的有效調(diào)控[3]。LIFU提供了一種空間分辨率高、穿透深度大的非侵入性技術(shù)，在基礎(chǔ)和臨床神經(jīng)科學(xué)研究中已被證明是一種有效的神經(jīng)調(diào)節(jié)工具[4-9]。LIFU可以通過傳遞機(jī)械振動來激活或抑制神經(jīng)元活動，而不會造成不可逆的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)通過改變超聲頻率、超聲強(qiáng)度、脈沖重復(fù)頻率、占空比及作用時間等超聲參數(shù)，不僅可以抑制刺激部位興奮性，而且可以根據(jù)聲強(qiáng)和能量沉積率增強(qiáng)其興奮性。Yoo等[10]用不同參數(shù)的LIFU刺激兔的視覺區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在100 Hz PRF、3.3 W/cm2Isppa的超聲作用下兔的視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）幅值降低，而較高強(qiáng)度的超聲作用導(dǎo)致VEP幅值升高。Kim等[11]在大鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的反應(yīng)。LIFU介導(dǎo)的神經(jīng)調(diào)節(jié)的這種雙向性特征，表明其在神經(jīng)治療應(yīng)用中具有多功能性。然而，這些研究中超聲脈沖參數(shù)的范圍相當(dāng)有限，需要進(jìn)一步的研究來闡明導(dǎo)致興奮性或抑制性神經(jīng)活動的脈沖參數(shù)。

近年來，為數(shù)不多的文獻(xiàn)以動物模型行為學(xué)為評價指標(biāo)報道了LIFU的神經(jīng)調(diào)控作用。孟文[12]將LIFU施加到阿爾茲海默癥疾病（Alzheimer' s disease，AD）模型小鼠的海馬上，觀察到各組小鼠在中央?yún)^(qū)活動時間無顯著差異，而AD小鼠的自主學(xué)習(xí)能力有所提升，結(jié)果表明超聲刺激沒有增加AD小鼠的焦慮情緒，但是提高了AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（100 Hz PRF、5%占空比）。Lin等[13]用LIFU刺激AD模型大鼠海馬，水迷宮實驗示超聲刺激組比模型組的逃避潛伏時間顯著縮短，說明LIFU顯著改善了AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（1 Hz PRF、5%占空比）。現(xiàn)有研究表明，超聲可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)水平，Min等[14]和Yang等[15]的研究顯示，LIFU作用于大鼠丘腦20 min，額葉細(xì)胞外GABA、DA、5-HT水平在超聲作用后開始下降，并在超聲作用2 h后保持在基線水平的82%左右。Wang等[16]使用超聲刺激PD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)超聲可以增加腦內(nèi)紋狀體DA含量，提高PD模型的運動能力。Constans等[17]使用FUS結(jié)合超聲造影劑安全開放了獼猴的血腦屏障，并增加了腦內(nèi)GABA的含量。

本實驗以正常小鼠為研究對象進(jìn)行超聲神經(jīng)調(diào)控的研究，從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)以及神經(jīng)生物化學(xué)多個方面評價超聲刺激后小鼠的改變。在行為學(xué)水平，實驗結(jié)果說明經(jīng)顱超聲刺激小鼠后產(chǎn)生了類似抑郁和焦慮的癥狀，學(xué)習(xí)記憶功能下降。在形態(tài)學(xué)方面，透射電鏡示超聲刺激后NAc神經(jīng)元腫脹，神經(jīng)纖維溶解、變性、壞死，胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少或消失。在神經(jīng)生物化學(xué)層面，ELISA結(jié)果示DA、NE、5-HT含量下降，表明超聲刺激一定程度上降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。綜上，本實驗研究結(jié)果表明聚焦超聲剌激對正常小鼠大腦有一定的抑制性神經(jīng)調(diào)控作用。本次研究采用1 000 Hz PRF，50%占空比的脈沖超聲刺激小鼠NAc，實驗結(jié)果示超聲刺激后小鼠單胺遞質(zhì)含量減少，影響了神經(jīng)信息的正常傳遞，情緒調(diào)節(jié)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，并產(chǎn)生了類似抑郁和焦慮的癥狀，得到了與上述研究相反的結(jié)果。針對這一結(jié)果作出以下可能的分析：本次研究采用了更高的PRF和占空比，超聲參數(shù)的不同可能引起不同的結(jié)果，孟文的研究[12]也說明了超聲對神經(jīng)元的調(diào)控具有雙向性。且上述研究使用AD模型小鼠，其神經(jīng)系統(tǒng)已發(fā)生了病理改變，而本次研究使用的是神經(jīng)系統(tǒng)功能正常的小鼠，這也可能是導(dǎo)致不同結(jié)果的原因之一。

綜上所述，本次研究給予小鼠NAc聚焦超聲剌激對小鼠大腦產(chǎn)生了一定的抑制性神經(jīng)調(diào)控作用，并在強(qiáng)迫游泳、曠場和水迷宮實驗結(jié)果中有所體現(xiàn)。且超聲誘導(dǎo)了NAc的形態(tài)學(xué)以及神經(jīng)生物化學(xué)改變，這可能是超聲發(fā)揮神經(jīng)調(diào)控作用的機(jī)制之一。

本實驗成功對小鼠進(jìn)行超聲神經(jīng)調(diào)控，誘導(dǎo)正常小鼠行為學(xué)、神經(jīng)元形態(tài)學(xué)以及神經(jīng)生物化學(xué)改變，證明LIFU對小鼠可產(chǎn)生抑制性的神經(jīng)調(diào)控作用，為其下一步應(yīng)用于疾病模型研究提供超聲參數(shù)依據(jù)以及機(jī)制研究基礎(chǔ)。