散發性左、右半腸癌錯配修復蛋白功能缺失與臨床病理特征的關聯分析

梁 磊 ，普 鑫 ，李文亮 ，馬淑敏 ，劉曉婷 ，孟烜宇 ，寇智勇 ，楊 軍

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤科；2）病案統計科，云南 昆明 650032）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率及死亡率分別占惡性腫瘤中第三位和第二位[1]，通常由微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）、染 色 體 不 穩 定（chromosomal instability，CIN）及CpG島甲基化3條途徑引起[2-3]。新近研究證實，由微衛星不穩定途徑引發的微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）/錯配修復蛋白缺失（deficient mismatch repair protein，dMMR）狀態的腸癌患者預后較好[4-5]，通過檢測MSI-H/dMMR可指導結直腸癌化療藥物的選擇[6]，用于結直腸癌患者預后評估[7]。MSI-H/dMMR分別可通過多重熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）及免疫組化（immunohistochemistry，IHC）進行檢測，兩者特異性及敏感性均＞90%[8]，可認為MSIH≈dMMR，由于IHC價格低廉、耗時較短[9]，因此臨床上更多用IHC進行檢測。

既往研究提示dMMR狀態與結直腸癌患者臨床病理特征存在相關性[10]。dMMR更多見于年輕、右半結腸、低分化、腫瘤直徑更大，粘液腺癌[11]以及UICC分期為I～II期[12]的結直腸癌患者。

為分析散發性左、右半腸癌dMMR與臨床病理特征的相關性，筆者收集了1 922例散發性腸癌患者資料，分析散發性左、右半腸癌dMMR狀態與臨床病理特征的關聯。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

收集昆明醫科大學第一附屬醫院2014年1月至2019年9月共計2 343例所有散發性腸癌患者資料，其中1 922例符合入組標準。散發性右半腸癌患者占23.99%，散發性左半腸癌患者占76.01%。男女比例為1.43：1；中位年齡62歲；CEA＜5 ng/mL占61.34%，CEA≥5 ng/mL占38.66%；中位腫瘤直徑為4 cm；病理類型：普通腺癌89.07%，粘液腺癌2.86%，混合腺癌（普通腺癌+粘液腺癌）8.07%；腫瘤分化程度：高分化腫瘤14.62%；中高分化腫瘤31.01%；中分化腫瘤42.09%；中低分化腫瘤6.71%，低分化腫瘤2.81%，未分化腫瘤2.76%；pT分期：pT1～T2者24.14%，pT3～T4者75.86%；淋巴結轉移者40.48%，淋巴結未轉移者59.52%，UICC分期：I～II期者57.54%，III～IV期者42.46%，淋巴結數目＜12個28.93%，淋巴結數目≥12個71.07%，遠處轉移5.78%，無遠處轉移94.22%，脈管侵犯者21.75%，無脈管侵犯者78.25%，神經侵犯者39.33%，無神經侵犯者60.67%，見表1。本研究為單中心臨床回顧性研究，經倫理委員會批準，豁免簽署病人知情同意書。

1.2 納入與排除標準

本研究篩選流程見圖1，納入及排除標準[10,13]如下：

納入標準：（1）經手術切除病理學證實為腺癌的散發性腸癌；（2）臨床病理信息完善者。

排除標準：（1）經手術切除病理學證實為非腺癌的腸癌；（2）遺傳性腸癌（家族性腺瘤性息肉病、Lynch綜合征及其他類型遺傳性腸癌）；（3）異時性或同時性多重癌；（4）術前接受新輔助治療者[14]；（5）臨床病理信息不全者。

1.3 觀測指標

本研究以脾曲為界，近端為右半結腸，遠端為左半結直腸。分別在散發性左、右半腸癌中收集錯配修復蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）、性別、年齡、體重指數（BMI）、民族、血型、術前CEA水平、腫瘤部位、病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、pT分期、pN分期、淋巴結檢出數目、遠處轉移、UICC分期、脈管侵犯（+）、神經侵犯（+）共18項臨床病理數據。

1.4 MMR檢測

1.4.1 MMR檢測方法所有標本均經 10% 中性甲醛液固定、石蠟包埋、HE 染色。免疫組化采用 Max Vision 二步法，石蠟切片脫蠟、水化后PBS 沖洗，過氧化物酶阻斷劑封閉內源性過氧化酶活性，加入一抗，室溫孵育，加生物素標記的二抗，加鏈霉素抗生物素的過氧化酶溶液，孵育后滴加 DAB 顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，封片。一抗為MSH2、MSH6、MLH1及PMS2，抗體及所用免疫組化試劑均購于中國福州邁新生物技術開發有限公司。

1.4.2 MMR結果判定4種蛋白的判斷標準一致[15-16]，結果由2名資深病理醫師雙盲獨立觀察評估。4種蛋白陽性表達均位于細胞核中，呈棕褐色；以正常上皮細胞或淋巴細胞作為陽性內對照，4個錯配修復蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）均陽性表達時可判定為錯配修復蛋白功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）；4種蛋白中任意一個或幾個出現表達缺失時，判定為錯配修復蛋白功能缺失（deficient mismatch repair，dMMR）。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析；計數資料采用率（%）表示，各項臨床病理因素與錯配蛋白表達之間的單因素分析選用χ2檢驗或Fisher確切概率法；多因素分析采用二元Logistic回歸模型，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 1 922例散發性腸癌錯配修復蛋白功能缺失情況

1 922例患者dMMR率為23.47%，右半腸癌dMMR率38.83%；左半腸癌dMMR率18.62%。其中MLH1、MSH2、MSH6及PMS2分別單獨表達缺失者分別為46例（2.39%）、18例（0.94%）、14例（0.73%）及146例（7.60%），MLH1與PMS2共同缺失者131例（6.82%），MSH2與MSH6共同缺失者23例（1.20%），4 種蛋白共同缺失者11例（0.57%），其他形式蛋白缺失者62例（3.23%），見圖2，表2。

表2 1922例散發性腸癌dMMR表型情況[n（%）]Tab.2 Different dMMR phenotype of all patients with sporadic colorectal cancer in the cohort [n（%）]

圖2 4種蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PSM2）表達情況及陽性對照Fig.2 Representative IHC results on mismatch repair proteins（MLH1，MSH2，MSH6 and PSM2）in colon cancer（Magnification，x400）.

2.2 1 922例散發性腸癌dMMR與臨床病理特征的關系

在1 922例散發性腸癌中，dMMR與臨床病理特征的單因素分析結果提示，dMMR與年齡，腫瘤直徑，分化程度、腫瘤部位、病理類型、神經侵犯、淋巴結檢出數目及UICC分期相關，見表1；多因素分析結果提示，dMMR更多見于年齡＜62歲，右半結腸癌、腫瘤直徑≥4 cm、中低分化、低分化及未分化、UICC分期為I～II期及無神經侵犯者，見表3。

表3 1922例散發性腸癌dMMR與臨床病理特征的多因素分析Tab.3 Multivariate results of the relationship between dMMR status and clinicopathological features of all patients with sporadic colorectal cancer in the cohort

2.3 461例散發性右半腸癌dMMR與臨床病理特征的關系

在461例散發性右半腸癌中，dMMR與臨床病理特征的單因素分析結果提示，dMMR與年齡，腫瘤浸潤深度相關，見表4；其中本研究的散發性右半腸癌的卡方分析發現，不論腫瘤直徑如何，其與dMMR不相關（P=0.074），但既往文獻[17]及本研究中所有腸癌的dMMR與腫瘤直徑存在相關性，將其與年齡，腫瘤浸潤深度進行多因素分析發現，散發性右半腸癌中dMMR更多見于年齡 ＜62歲，pT1～T2，腫瘤直徑≥4 cm者，見表5。

表4 461例散發性右半腸癌MMR與臨床病理特征的關系[n（%）]Tab.4 Relationship between different MMR status and clinicopathological characteristics of the 461 patients with right-side colon cancer in the cohort [n（%）]

續表4

表5 461例散發性右半腸癌dMMR與臨床病理特征的多因素分析Tab.5 Multivariate results of the relationship between dMMR status and clinicopathological features of the 461 patients with right-side colon cancer

2.4 1 461例散發性左半腸癌dMMR與臨床病理特征的關系

在1 461例散發性左半腸癌中，dMMR與臨床病理特征的單因素分析結果提示，dMMR與年齡，腫瘤分化程度，腫瘤直徑，檢出淋巴結數目，有無神經侵犯有關，見表6；多因素結果分析提示，散發性左半腸癌中dMMR更多見于年齡＜62歲，腫瘤直徑≥4 cm及無神經侵犯者，見表7。

表6 1 461例散發性左半腸癌MMR與臨床病理特征的關系 [n（%）]Tab.6 Relationship between different MMR status and clinicopathological characteristics of the 1 461 patients with left-side colon cancers in the cohort [n（%）]

續表6

表7 1 461例散發性左半腸癌dMMR與臨床病理特征的多因素分析Tab.7 Multivariate results of the relationship between dMMR status and clinicopathological features of the 1 461 patients with left-side colon cancer

3 討論

結直腸癌中，dMMR與年輕、右半結腸、腫瘤直徑更大、檢出淋巴數目更多以及病理分期等臨床病理因素有關[10]。由于左、右半腸癌在流行病學、病理、細胞遺傳及分子特征等方面存在明顯的差異，1990年，Bufill[18]提出近端和遠端結直腸癌即左右半結腸癌是兩種截然不同的腫瘤，然而，在散發性左、右半腸癌中，dMMR與上述結論是否一致目前未知；本研究以橫結腸脾曲為界，在散發性左、右半腸癌中分別分析dMMR與不同臨床病理特征的相關性。

在本研究中，所有散發性腸癌患者dMMR更多見于年齡＜62歲，右半腸癌、腫瘤直徑≥4 cm、中低分化、低分化及未分化、UICC分期為Ⅰ～Ⅱ期、無神經侵犯者，這與既往報道基本一致[5,19]。在散發性右半腸癌中，dMMR與年齡，pT以及腫瘤直徑相關；在散發性左半腸癌中，dMMR與年齡，腫瘤直徑以及無神經侵犯者相關，見圖3。

圖3 散發性左、右半腸癌dMMR狀態與臨床病理特征的關系Fig.3 Association of mismatch repair deficiency and clinicopathological parameters in patients with left-side and right-side sporadic colon cancer

在本研究中，1922例散發性腸癌的dMMR率為23.46%。國外dMMR率相對較低為8.4%[20]，但高者可達34%[21]，而國內的不同地區dMMR率（7.8%～17.9%）也不盡相同[13,14,22,23]。上述結果提示，在不同人種以及不同地區的dMMR率存在差異，本研究的dMMR率相對較高可能與以下因素相關：（1）人種的不同導致錯配修復蛋白的表達不盡相同；（2）地域環境的差異導致錯配修復蛋白的表達存在差異；（3）雖然錯配修復蛋白缺失的判斷標準統一，但解釋結果存在一定主觀性，可能存在偏倚[24]。

在本研究的散發性右半腸癌中，右半腸癌的dMMR率為38.83%。通過多因素回歸分析發現，在散發性右半腸癌中，dMMR多見于年齡＜62歲，腫瘤直徑≥4 cm者以及pT1～T2者。除了年齡及腫瘤直徑這兩個因素以外，本研究首次發現，在散發性右半腸癌中的pT1～T2者（P=0.000，OR=3.778）較高頻率出現dMMR。與左半腸癌不同的是，散發性右半腸癌患者大體類型多為腫塊型，局部浸潤層次較淺，從本研究數據來看，散發性右半腸癌中T1～T2的患者共54例，其中dMMR者33例，占比61.11%相對較高，此外散發性右半腸癌多數由絨毛狀腺瘤發展而來，這也提示對于腺瘤癌變者，其dMMR率相對較高。

在散發性左半腸癌中，左半腸癌dMMR率18.62%。本研究首次發現，在左半腸癌中，dMMR更多見于無神經侵犯者（OR=1.454，P=0.009）。在本研究中，散發性左半腸癌無神經侵犯者共891例，其中dMMR表型者181例，占比20.31%，對于本研究中首次發現的dMMR更多見于無神經侵犯者，需擴大樣本進行驗證，相關機制需后續試驗進一步探討。

綜上所述，在散發性腸癌中，不論腫瘤部位如何，dMMR均與年齡＜62歲，腫瘤直徑≥4 cm存在相關關系；然而，本研究發現，散發性左、右半腸癌dMMR表型分別與神經侵犯（-）及pT1～T2分期相關。

本研究為單中心回顧性研究；由于潛在的局限性，不可避免的產生偏倚；缺少預后數據；本研究樣本量較小，需更大樣本量、多中心、前瞻性研究進一步佐證。