降鈣素受體基因多態性與昆明地區2型糖尿病伴骨質疏松癥的相關性

李博一，牛 玲，馬 蓉，張 嫻，劉 方，唐 艷，苗翠娟，韓竺君，張 程

（昆明市第一人民醫院內分泌科，云南 昆明 650011）

隨著人們生活水平的提高和壽命的延長，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus）和骨質疏松癥的發病率逐年上升，據國際糖尿病聯盟（international diabetes federation，IDF）預計2030年T2DM發病率將翻倍，而中國T2DM將達到4 230萬人，骨質疏松癥的發病率也已躍居各種常見病的第7位，已成為全球主要的公共衛生問題[1]。在眾多的發病因素中，遺傳是T2DM和骨質疏松癥主要的發病原因，有研究認為，糖尿病性骨質疏松是一種多基因遺傳病，這些基因[2]包括降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）基因，維生素D受體基因及護骨素基因等。對CTR基因型多態性與骨質疏松癥的相關性，國內外研究結果尚不一致。CTR基因型與T2DM伴骨質疏松癥的關系研究較少。本研究旨在探討CTR基因多態性與昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的相關性，持續為昆明地區T2DM伴骨質疏松癥防治提供理論依據，并早期防治糖尿病性骨質疏松，提高糖尿病患者的生活質量。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年6月至2019年1月在昆明市第一人民醫院甘美醫院內分泌科住院的2型糖尿病患者237例。糖尿病診斷標準：參考2013年版《中國2型糖尿病防治指南》[3]；骨質疏松診斷標準：參考2011年版《原發性骨質疏松癥診治指南》[4]。納入標準：（1）T2DM；（2）昆明地區居住時間大于10 a。排除標準：（1）1型糖尿病；（2）各種糖尿病急性并發癥、感染、營養不良及嚴重的心肝腎臟疾病及腫瘤患者；（3）甲狀腺手術史，合并其他可能引起甲狀腺激素代謝異常的其他內分泌、免疫系統疾病、結締組織病者，如垂體瘤、垂體功能減退者，亞急性甲狀腺炎等；（4）皮膚疾病無法接受陽光照射者；（5）存在風濕或類風濕關節炎，且應用激素類藥物時間超過6個月，或曾經接受活性維生素D、降鈣素、雌激素受體調節劑等影響骨代謝的藥物治療者；（6）存在畸形性骨關節炎者和成骨不全患者。按骨密度檢測結果分組為糖尿病無骨質疏松癥（A組）61例，占25.7%；糖尿病合并骨量減少組（B組）111例，占46.8%；糖尿病伴骨質疏松組（C組）65例，占27.4%。男性122例，女性115例，年齡50～84歲，平均年齡（64.68±7.92）歲。納入研究對象均簽署知情同意書，且本研究經昆明市第一人民醫院醫學倫理學委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指標測試當日由專人用固定體重身高測量儀測定：體重、身高、計算BMI，記錄年齡、性別、糖尿病的病程。

1.2.2 血壓測定采用汞柱式標準袖帶血壓表，休息5 min 后測定坐位右上臂收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP），單位mmHg，（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.2.3 其他生化指標測定受試者隔夜禁食8～12 h，清晨取靜脈血測FPG、HbA1c、肝腎功能電解質（血鈣）、血脂、UA、維生素D濃度、雌激素水平、睪酮水平，Hs-CRP、FIB。按標準方法行OGTT試驗，檢測OGTT-0 h、2 h血糖，采用化學發光法測定0 h、2 h INS水平，并計算HOMA-IR。

1.2.4 外周血基因組DNA提取空腹采集靜脈血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，標本收集結束后購進DNA提取試劑盒統一提取CTR基因。具體所需試劑及儀器見表1。

1.2.5 PCR擴增（1）擴增所使用的引物：上游引物5′-CTCAGTGATCACGATACTGTG-3′；下游引物5′-TTCAGT GGAACCAGCGTTGG-3′；（2）PCR反應體系：共25 μL，包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，碩擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，碩擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR反應條件：共35個循環，95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反應完成后，72 ℃再延伸10 min。

1.2.6 酶切鑒定基因型PCR擴增產物用AluⅠ內切酶酶切后，置于2%瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察基因型。

1.2.7 骨密度測量采用通用電氣醫療系統（中國）有限公司生產的雙能x線骨密度儀（型號DPX Bravo）測量腰椎L1-L4，股骨頸及髖部骨密度（BMD），單位g/cm2。

1.3 統計學處理

本研究的所有數據均使用SPSS11.5軟件包進行統計處理。采用Hardy-Weinberg平衡檢測基因型的分布是否具有代表性。正態分布計量資料用均數±標準差（）表示，3個獨立樣本比較，采用方差分析，組間比較用最小有意義差異法（LSD檢驗）。2個獨立樣本比較，采用t檢驗。非正態分布計量資料用M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素Logistic回歸分析篩選獨立危險因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組人群一般資料比較

結果顯示：3組患者年齡、身高、體重、BMI比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 研究對象的一般資料比較[（），M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study subjects [（），M（P25，P75）]

表2 研究對象的一般資料比較[（），M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study subjects [（），M（P25，P75）]

總體比較：*P＜0.05；兩兩比較：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，&P＜0.05。

2.2 CTR基因型和等位基因頻率的分布

2.2.1 CTR基因型酶切電泳圖CTR基因AluI酶切位點多態性確定為：CC 型228 bp；CT 型228 bp和120 bp；TT 型120 bp，見圖1。

圖1 CTR基因型酶切電泳圖Fig.1 CTR genotype digestion electrophoresis diagram

2.2.2 CTR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明所選人群代表性好。在237例人群中，CTR基因型分布情況為：CC型181例（76.4%），CT型56例，（23.6%），TT型未檢出。提示昆明地區2型糖尿病患者中，CTR基因型以CC型為主，未見TT型。在65例糖尿病合并骨質疏松組中CTR基因型分布情況為：CC型49例（75.4%），CT型16例（24.6%），TT型未檢出。提示昆明地區2型糖尿病合并骨質疏松中，CTR基因型仍以CC型為主，未見TT型。

2.2.3 3組人群CTR基因型分布頻率比較結果顯示：TT基因型在人群中均未檢出，CTR基因型CC、CT無統計學差異（P＞0.05），見表3。

表3 CTR基因型分布頻率比較[n（%）]Tab.3 Comparison of CTR genotypes distribution frequency [n（%）]

2.2.4 3組人群CTR等位基因分布比較結果顯示：等位基因C、T的分布頻率無統計學差異（P＞0.05），見表4。

表4 CTR等位基因分布頻率Tab.4 CTR allele frequency distribution

2.2.5 CTR基因多態性與T2DM患者BMD的關系結果顯示：237例T2DM患者中，CTR不同基因型在各部位的BMD值差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 CTR基因多態性與T2DM患者BMD的關系[（g/cm2），（）]Tab.5 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

表5 CTR基因多態性與T2DM患者BMD的關系[（g/cm2），（）]Tab.5 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

2.2.6 CTR基因多態性與T2DM伴骨質疏松癥患者BMD的關系結果顯示：65例T2DM伴骨質疏松癥患者中，CTR不同基因型在各部位BMD值差異無統計學意義（P＞0.05），見表6。

表6 CTR基因多態性與T2DM伴骨質疏松癥患者BMD的關系[（g/cm2），（）]Tab.6 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients with osteoporosis [（g/cm2），（）]

表6 CTR基因多態性與T2DM伴骨質疏松癥患者BMD的關系[（g/cm2），（）]Tab.6 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients with osteoporosis [（g/cm2），（）]

2.2.7 T2DM伴骨質疏松患者多因素Logistic回歸分析結果將CTR基因型（1為CC型，2為CT型）及單因素分析3組間具有統計學差異的變量，即性別（0為女，1為男）、年齡、舒張壓、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮作為因變量，糖尿病有無骨質疏松（0為無，1為有）作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，以篩選糖尿病伴骨質疏松的獨立危險因素。結果顯示：年齡（OR1.112、95%CI：1.034～1.196、P=0.004）可以進入回歸方程，見表7。

表7 Logistic回歸分析結果Tab.7 Logistic analysis results

參考類別說明：“CTR基因型”中的CC型，“性別”以女性，“糖尿病有無骨質疏松”以糖尿病無骨質疏松作為參考類別。

3 討論

T2DM是一種嚴重的高風險疾病，除血糖升高外，心、腦、眼、腎、神經等全身并發癥是T2DM致死、致殘、致盲的主要原因。有研究表明，與糖尿病有關的并發癥中如喪失的視力均可增加骨折風險[5]。

T2DM伴骨質疏松癥發病機制非常復雜，近年來各國學者對T2DM與骨質疏松癥的相關性研究日益增多，目前認為發病機制除了與年齡、性別、體重、營養、生活方式有關外，環境和遺傳因素亦起著重要作用。對CTR基因多態性的研究在國際上已經引起了重視，CTR基因多態性與骨質疏松的相關性已有大量報道，而CTR基因多態性與T2DM并骨質疏松癥的相關性研究在國內外報道較少。

本研究中的一般臨床資料顯示：從T2DM無骨質疏松癥組到T2DM合并骨量減少組再到T2DM伴骨質疏松組年齡呈逐漸增加趨勢，且不論是總體比較還是兩兩比較有統計學意義，說明隨著年齡的增長，T2DM患者患骨質疏松癥的風險增加，且Logstic回歸分析顯示：年齡是昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的獨立危險因素，說明昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的發病與年齡相關。BMI無論3組比較還是兩兩比較差異具有統計學意義，提示伴隨BMI降低，昆明地區T2DM患骨質疏松癥的風險增加。高BMI一度被認為是T2DM骨密度的保護性因素[6]。原因可能是：（1）BMI較高，在重力作用下骨骼機械負荷增加，有助于維持骨量[7]；（2）脂肪組織較為發達，使雄激素向雌激素轉換，骨吸收作用減少[8]；（3）脂肪細胞分泌脂聯素、瘦素等脂肪因子，脂聯素可以促進骨形成，瘦素下調RANKL活性，抑制破骨細胞分化及骨吸收，同時瘦素還能促進成骨細胞增殖、分化和活性[6]。所以適當增加體重對防治T2DM并發骨質疏松有積極的意義。

CTR不同等位基因的檢出率在不同種族和地域存在差異。本研究發現昆明地區T2DMCTR基因型分布頻率為：CC型76.4%、CT型23.6%，TT型未檢出；T2DM伴骨質疏松CTR基因型分布頻率為：CC型75.4%，CT型24.6%，TT型未檢出。這與北京[9]、廣州[10]研究結果相近似，與臺灣[11]、日本地區[12]的研究結果亦相似。Masi等[13]對意大利、Bandres等研究結果顯示CTR基因多態性基因型的分布頻率與高加索人群非常接近（從高到低依次是CT、TT、CC），與亞洲人不同。

本研究中，A組CTR基因型分布頻率分別為CC型80.3%、CT型19.7%、TT型 0%、B組CTR基因型分布頻率分別為CC型74.8%、CT型25.2%、TT型0%、C 組CTR基因型分布頻率分別為CC型75.4%、CT型24.6%、TT型0%，3組基因型分布頻率比較，CTR3種基因型CC、CT、TT的分布頻率及等位基因分布頻率差異無顯著統計學意義。這種多態性分布表明種族、飲食、生活習慣對遺傳因素的影響可能與同一種族產生相同的基因頻率有關，而與伴隨疾病T2DM及T2DM合并骨質疏松癥可能無關。

筆者將CTR基因型及單因素分析3組間具有統計學差異的變量作為因變量，糖尿病合并骨質疏松作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，以篩選糖尿病合并骨質疏松的獨立危險因素，本研究顯示年齡是昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的獨立危險因素，CTR基因型未進入回歸方程，說明CTR基因型未增加T2DM人群患骨質疏松癥的風險，CTR基因型與昆明地區T2DM及 T2DM伴骨質疏松癥遺傳易感性不相關。同時比較T2DM患者CTR基因型中不同部位的骨密度，結果顯示CTR不同基因型在各部位的骨密度值差異無統計學意義，提示CTR基因型可能不是T2DM患者BMD改變的易感基因，這與楊軍等[7]研究相符。而對于糖尿病伴骨質疏松的患者，筆者也比較了CTR基因型在不同部位的骨密度，結果顯示CTR不同基因型在各部位的骨密度值差異無統計學意義，說明T2DM和骨質疏松癥受多個基因調控，多個易感基因組合構成了該病的遺傳易感性，每個單一基因在遺傳易感性中所起的決定作用不同，因此導致了CTR 基因多態性與T2DM和T2DM合并骨質疏松癥患者BMD相關性的不同。

總之，T2DM和骨質疏松癥均是多因素疾病，相關的候選基因有很多，單一基因的作用是有限的，CTR基因的多態性是其核苷酸序列1 377處的C突變為T，它的突變可能是影響其與其配體的結合和改變受體信號轉導系統從而調節疾病發生發展，具體病理生理機制還不太清楚。CTR基因多態性與T2DM伴骨質疏松癥的相關性研究一方面有助于從分子水平解釋T2DM伴骨質疏松癥發病的遺傳學機制，另一方面亦可以應用于評估T2DM骨折的危險性。因此，T2DM伴骨質疏松癥的相關基因研究應更加廣泛和深入，進行多種族、多地域、大樣本的研究，并綜合考慮諸多因素的協同作用。