維生素D受體基因多態性與昆明地區2型糖尿病伴骨質疏松癥的關系

牛 玲 ，李博一 ，毛靜秋 ，唐 艷 ，馬 蓉 ，劉 方 ，張 程 ，韓竹君 ，苗翠娟 ，張 嫻

（1）昆明市第一人民醫院內分泌科；2）檢驗科，云南 昆明 650011）

糖尿病患者易同時合并骨質疏松癥。由于骨質疏松導致的骨折和骨折致殘嚴重影響患者生活，同時給家庭、社會帶來沉重經濟負擔。因此重視防治糖尿病性骨質疏松對于提高糖尿病患者的生活質量具有重要意義。遺傳是T2DM和OP重要的發病因素，有研究[1]認為糖尿病性骨質疏松是一種多基因遺傳病，這些基因包括降鈣素受體基因、維生素D受體（vitamin dreceptor，VDR）基因及護骨素基因等。目前，對VDR基因多態性與骨質疏松癥的關系研究報道較多，但國內研究結果尚不完全一致。本研究旨在探討VDR基因多態性與昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的關系，以期為昆明地區T2DM伴骨質疏松癥防治提供理論依據，并早期防治糖尿病性骨質疏松，提高糖尿病患者的生活質量。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年6月至2019年1月在昆明市第一人民醫院內分泌科住院治療的2型糖尿病患者237例，其中男性122例，女性115例，年齡50～84歲，平均（64.68±7.92）歲。2型糖尿病診斷標準采用2013年版《中國2型糖尿病防治指南》標準診斷糖尿病[2]。骨質疏松癥診斷標準采用2011年版《原發性骨質疏松癥診治指南》標準診斷[3]，按T值評分診斷骨質疏松。所有入選的2型糖尿病患者在昆明地區居住時間均大于10 a。排除標準：（1）1型糖尿病，繼發性糖尿??；（2）各種糖尿病急性并發癥、伴有感染、營養不良、嚴重心腦及肝腎疾病、腫瘤患者；（3）甲狀腺手術史，合并其他可能引起甲狀腺激素代謝異常的其他內分泌、免疫系統疾病、結締組織病者，如垂體瘤、垂體功能減退者，亞急性甲狀腺炎等；（4）皮膚疾病無法接受陽光照射者；（5）存在類風濕或風濕或關節炎，且應用激素類藥物時間超過6個月，或曾經接受活性維生素D、降鈣素、雌激素受體調節劑等影響骨代謝的藥物治療者；（6）存在畸形性骨關節炎者和成骨不全患者。納入的研究對象均簽署知情同意書，且本研究經昆明市第一人民醫院醫學倫理學委員會批準。

1.2 分組

（1）將237例患者按骨密度檢測結果分為糖尿病無骨質疏松癥61例；糖尿病合并骨量減少111例；糖尿病伴骨質疏松65例。

（2）將237例患者按VDR基因型分組為：BB組31例，占13.1%；Bb組184例，占77.6%，bb組22例，占9.3%。

1.3 研究方法

1.3.1 一般指標記錄年齡、性別、糖尿病病程，男性是否吸煙，男性是否飲酒（注：所有女性患者均不吸煙，不飲酒）。測試當日由專人用固定體重/身高測量儀測定：體重、身高、計算體重指數（BMI），單位kg/m2。

1.3.2 血壓指標采用汞柱式標準袖帶血壓表，休息5分鐘后測定坐位右上臂收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP），單位mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.3.3 其他生化指標受試者隔夜禁食8～12 h，清晨取靜脈血測空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、肝腎功能電解質（血鈣）、血脂、尿酸（UA）、維生素D濃度、雌激素水平、睪酮水平，超敏C反應蛋白（Hs-CRP）、纖維蛋白原（FIB）。按標準方法行OGTT試驗，檢測OGTT-0 h、2 h血糖，采用化學發光法測定0 h、2 h胰島素（INS）水平（單位：mIU/L）。再采用穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMA-IR）：HOMA-IR=FINS X FPG/22.5，FINS單位為mIU/L，FPG即OGTT-0 h，單位為mmol/L。低的HOMA-IR示高胰島素敏感性，而高的HOMA-IR表示胰島素敏感性差，存在胰島素抵抗。

1.3.4 外周血基因組DNA提取空腹采集靜脈血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，標本收集結束后購進DNA提取試劑盒統一提取VDR基因。所需試劑及儀器為：DNA提取試劑盒，購于AXYGEN公司；DNA聚合酶（2×Taq Master Mix）購于Bioteke公司，引物由昆明碩擎公司合成；普通PCR儀購于美國應用生物系統公司（型號ABI2720）；各種規格的離心管、槍尖、PCR管、一次性乳膠手套和口罩購于NSET公司。

1.3.5 PCR擴增（1）擴增所使用的引物（Bsm I位點）：上游引物5′-GAACCAAGACTACAAGTACC GCGTCAGTGA-3′；下游引物5′-TGGCGGCAGCG GATGTACGTCTGC-3′；（2）PCR反應體系：25 μL混勻液體。包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，碩 擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，碩擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR反應條件：共35個循環，95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反應完成后，72 ℃再延伸10 min；（4）酶切鑒定基因型：PCR擴增產物用BsmⅠ酶酶切后，置于2%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。

1.3.6 骨密度測量采用通用電氣醫療系統（中國）有限公司生產的雙能X線骨密度儀（型號DPX Bravo）測量腰椎L1～L4、股骨頸、髖部骨密度及T值評分（BMD），單位g/cm2。

1.4 統計學處理

本研究的所有數據均使用SPSS11.5軟件包進行統計處理。采用Hardy-Weinberg平衡檢測基因型的分布是否具有代表性。正態分布計量資料用均數±標準差（）表示，3個獨立樣本比較，采用方差分析，組間比較用最小有意義差異法（LSD檢驗）。非正態分布計量資料用（MP25，P75）表示，采用秩和檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素Logistic回歸分析篩選獨立危險因素。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組人群一般資料比較

3組人群一般資料比較，結果顯示：3組患者性別、年齡、吸煙、飲酒、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮差異均有統計學意義（P＜0.05），且在T2DM伴骨質疏松組與無骨質疏松組比較時，上述指標均有統計學差異（P＜0.05），見表1。

表1 研究對象的一般資料比較[，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data of study subjects [，M（P25，P75）]

表1 研究對象的一般資料比較[，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data of study subjects [，M（P25，P75）]

總體比較：*P＜0.05，兩兩比較：與無骨質疏松組比較，#P＜0.005，；與合并骨量減少組比較，&P＜0.05。

2.2 VDR基因型及等位基因頻率分布情況

2.2.1 VDR基因型酶切電泳圖結果顯示：VDR基因經Bsm I酶酶切后對應的基因型有3種：純合子BB 型825 bp一條帶；雜合子Bb 型825 bp、675 bp、150 bp三條帶；純合子bb 型675 bp、150 bp兩條帶，見圖1。

圖1 VDR基因型酶切電泳圖Fig.1 VDR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.2 VDR基因型分布情況VDR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明所選人群代表性好.在237例人群中，VDR基因型分布情況為：BB型31例，占13.1%，Bb型184例，占77.6%，bb型22例，占9.3%。提示昆明地區糖尿病患者中，VDR基因型以Bb型為主。

2.2.3 3組人群VDR基因型分布頻率比較結果顯示：3組人群VDR基因型BB，Bb，bb基因型比較，無統計學差異（χ2=6.456，P=0.168），見表2。

表2 VDR基因型分布頻率比較[n（%）]Tab.2 Comparison of VDR genotypes distribution frequency [n（%）]

2.2.4 3組人群VDR等位基因分布比較3組人群VDR等位基因B、b的分布頻率無統計學差異（χ2=1.953，P=0.162），見表3。

表3 VDR等位基因分布頻率比較Tab.3 VDR allele frequency distribution

2.2.5 VDR基因多態性與2型糖尿病患者BMD的關系結果顯示：237例T2DM患者中，VDR不同基因型在各部位的BMD值差異均無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 VDR基因多態性與2型糖尿病患者BMD的關系[（g/cm2），（）]Tab.4 The relationship between the VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

表4 VDR基因多態性與2型糖尿病患者BMD的關系[（g/cm2），（）]Tab.4 The relationship between the VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

2.3 多因素Logistic回歸分析結果

將VDR基因型（1為BB型，2為Bb型，3為bb型）及單因素分析3組間具有統計學差異的變量，即性別（0為女，1為男）、年齡、吸煙（0為無，1為有）、飲酒（0為無，1為有）、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮作為因變量，糖尿病有無骨質疏松作為自變量（0為無，1為有），進行多因素Logistic回歸分析，以篩選糖尿病伴骨質疏松的獨立危險因素。結果顯示：年齡（OR1.115、98%CI：1.035～1.202、P=0.004）、吸煙（OR10.318、95%CI：1.637～65.046、P=0.013）可以進入回歸方程，見表5。

表5 Logistic回歸分析結果Tab.5 Logistic analysis results

參考類別說明：“VDR基因型”中的BB型，“性別”以女性，“吸煙”以不吸煙，“飲酒”以不飲酒，“糖尿病有無骨質疏松”以糖尿病無骨質疏松作為參考類別。

3 討論

糖尿病患者骨質疏松發病率明顯升高[4]。國內有報道[5]，近1/3的糖尿病患者可診斷為骨質疏松癥。然而，T2DM伴骨質疏松癥的發病機制非常復雜，糖尿病高血糖狀態、糖尿病慢性并發癥、糖基化終末產物（AGEs）、氧化應激損傷、胰島素及胰島素樣生長因子分泌的減少、炎癥因子（CRP、IL-6等）水平的升高等均可能影響骨代謝[6-8]。另外，年齡、性別、吸煙、體重、生活方式、營養狀態、環境和遺傳等均是重要的影響因素。目前，對于VDR基因多態性與2型糖尿病伴骨質疏松癥的研究，國內外已有不少報道，但結果多有不同。

本研究結果顯示：從無骨質疏松癥組-骨量減少組-骨質疏松癥組，女性占比增多，分別是15例（24.6%），50例（45%），50例（76.9%）；而身高、體重、BMI逐漸下降，提示女性2型糖尿病患者更易患骨質疏松；而體重可能是2型糖尿病患者骨質疏松的保護性因素。但進一步Logstic回歸分析顯示：性別、身高、體重、BMI 均未進入回歸方程，尚不能說明性別、體重是昆明地區T2DM伴骨質疏松的癥的獨立危險因素。

從無骨質疏松組-骨量減少組-骨質疏松癥組，年齡逐漸增加，男性吸煙占比也增大，分別是24例（52.2%），32例（52.5%），11例（73.3%）。進一步Logstic回歸分析顯示：年齡、吸煙均進入回歸方程，說明年齡、吸煙是昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的獨立危險因素，與曹國磊[9]的研究結果一致。有研究表明，長期吸煙可能導致鎘在人體慢性蓄積，鎘的蓄積可以加速骨量丟失，最終導致骨質疏松的發生發展[10-11]。

本研究還觀察到，VDR（Bsm I）基因型分布頻率為：BB型13.1%、Bb型77.6%，bb型9.3%，提示昆明地區T2DM患者VDR（Bsm I）基因型以Bb型為主。在T2DM伴骨質疏松患者中，VDR基因型分布頻率為：BB型12.3%、Bb型75.4%，bb型12.3%，提示昆明地區T2DM伴骨質疏松患者VDR（Bsm I）基因型也以Bb型為主。這與北京[12]、廣州[13]地區的研究結果不一致。這可能與VDR基因多態性在不同地域存在差異有關。

在2型糖尿病患者中，無骨質疏松組，骨量減少組，骨質疏松組3組比較，VDR基因型分布頻率及等位基因頻率均無統計學差異。梁偉對廣州地區的漢族人群研究發現[13]：正常骨量組，骨質疏松組，2型糖尿病合并骨質疏松組比較，3種酶（Bsm I，Apa I，Taq I）定義的VDR基因型均無統計學差異，筆者的結果與之一致。國內張紅紅[14]的研究也認為VDR基因與骨質疏松無關。國外Lim等[15]對荷蘭人群的研究發現VDR基因多態性與骨質疏松無關聯。Hansen等[16]對丹麥絕經婦女的研究也認為VDR基因多態性不能預測該人群的骨密度及骨量丟失。進一步按VDR基因型分組比較發現，不同基因型間不同部位的骨密度數值也無統計學差異，提示VDR基因型可能不是T2DM患者骨密度降低的易感基因。將VDR基因型及單因素分析中具有統計學差異的變量作為因變量，糖尿病有無骨質疏松作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析發現，VDR基因型未進入回歸方程，提示VDR基因型尚未增加T2DM人群患骨質疏松癥的風險，VDR（Bsm I）基因型與昆明地區 T2DM伴骨質疏松癥的遺傳易感性無關。

綜上所述，T2DM伴骨質疏松癥的影響因素及相關候選基因較多，單一基因的作用是有限的，基因多態性在不同國家、種族、地域也存在較大差異。筆者的研究發現，年齡，吸煙是T2DM伴骨質疏松癥的獨立危險因素，但未發現VDR（Bsm I）基因型與昆明地區 T2DM伴骨質疏松癥的遺傳易感性相關。有待進行更加廣泛、深入、大樣本、多種族、多地域、多個基因的聯合研究，以為2型糖尿病骨質疏松的防治工作提供更多的信息和依據。