基于網絡藥理學探討黃芪治療支氣管哮喘的作用機制

李竹英 陳 璐 袁星星 王 婷 張 玉 連夢堯 李 星

1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院呼吸科，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學研究生院，黑龍江哈爾濱 150040；3.齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江齊齊哈爾 161000

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是一種慢性氣道炎癥性疾病，因其不斷增長的發病率和死亡率而備受世界關注。中國肺健康研究顯示，目前我國哮喘患病人數約4570 萬，總體發病率達4.2%[1]。西醫治療哮喘最有效的藥物為糖皮質激素，雖然其具有較強的抗炎作用，但是長期服用會造成口咽念珠菌感染、聲音嘶啞等副作用，給患者帶來較大的心理負擔。近年來，中藥治療哮喘越來越受到重視，具有藥性溫和、藥效持久、副作用小、成本低廉等優勢。

黃芪顆粒、黃芪注射液及黃芪類復方對哮喘的治療有積極的作用，可以提高患者的臨床控制率，減輕氣道炎癥反應，增強機體免疫功能，改善肺功能[2-4]。黃芪味甘性微溫，歸脾、肺經，有補氣健脾、益衛固表之效。現代藥理研究證實，黃芪具有興奮呼吸中樞、免疫調節、抗炎、抗缺氧、提高機體的抗病力等作用。已有數據表明，黃芪的化學成分可通過調控相關的炎癥因子及基因蛋白等途徑發揮治療哮喘的作用[5-6]。但目前的研究多從單一成分或單一靶點對黃芪治療哮喘的機制進行探討，很難闡明中藥治療疾病的整體性與系統性。因此，本研究基于網絡藥理學的方法，從多維度探究黃芪治療哮喘的活性成分、作用靶點和相關通路，為黃芪治療哮喘機制的系統研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分及靶點獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）輸入“黃芪”檢索其化學成分，再根據口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 的標準篩選出符合條件的活性化學成分[7]。然后在TCMSP 中，利用蛋白質數據庫（Uniprot）篩選出黃芪中的活性化學成分所對應的靶點蛋白基因名，重復靶點僅保留1 個，所得靶點即為黃芪活性化學成分的預測靶點。

1.2 哮喘相關靶點的獲取

以“asthma”為檢索詞從Genecards 網絡平臺庫中檢索哮喘的相關靶點。同時將黃芪活性化學成分的預測靶點與哮喘的相關靶點在Venny 2.1.0 中映射篩選出共同靶點，即為黃芪作用于哮喘的潛在靶點。

1.3 黃芪-化合物-靶點-哮喘網絡構建

將黃芪活性化合物及“1.2”中獲取的潛在靶點導入Cytoscape 3.7.0 中，構建黃芪-化合物-靶點-哮喘網絡，通過計算節點的度值（degree）來篩選關鍵化合物。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將“1.2”中獲取的潛在靶點導入STRING 數據庫，獲取PPI 數據，將PPI 數據導入Cytoscape 3.7.0 中構建網絡圖。

1.5 基因本體論（GO）功能富集分析及日本京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

基于R 語言軟件，利用Bioconductor 生物信息軟件包對黃芪作用于哮喘的潛在靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，通過R 語言中“Cluster profiler”進行可視化處理，設定閾值P ＜0.05 為指標進行篩選，選取P 值由小到大前20 條目制圖。

2 結果

2.1 黃芪活性成分及靶點篩選結果

從TCMSP 平臺中搜索符合標準的黃芪活性化合物19 個。見表1。將所獲得的活性化合物對應的靶點蛋白名導入Uniprot 數據庫進行基因標準化，刪除重復項，共得到黃芪活性化合物的預測靶點97 個。

表1 黃芪活性化合物信息

2.2 哮喘相關靶點的獲取結果

在Genecards 數據庫中搜索到哮喘相關靶點5973 個，將97 個黃芪活性化合物的預測靶與哮喘相關靶點進行映射，取二者交集得到共同靶點81 個。見圖1。

圖1 哮喘相關靶點與黃芪活性化合物的預測靶點韋恩圖

2.3 黃芪-化合物-靶點-哮喘網絡構建結果

網絡中共有96 個節點和272 條邊，見圖2。靶點數較多的前5 位化合物依次為槲皮素（65 個）、山奈酚（29 個）、異鼠李素（15 個）、刺芒柄花素（13 個）、毛蕊異黃酮（10 個），其可能是黃芪發揮治療哮喘作用的關鍵化合物。

圖2 黃芪-化合物-靶點-哮喘網絡

2.4 PPI 網絡構建結果

為進一步研究黃芪治療哮喘的作用機制，將映射所得81 個共同靶點進行PPI 網絡分析并進行可視化處理，網絡圖中包括18 個節點，89 條邊，圖中節點的大小表示靶點的degree 值，顏色由黃色到紫色，表示靶點的度值由小到大，見圖3（封三）。絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、表皮生長因子受體（EGFR）、白細胞介素（IL）-6、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、血管內皮生長因子（VEGF）、MYC 的degree 值排名靠前，可能是黃芪發揮中醫臨床功效及與哮喘產生關聯的關鍵作用靶點。

圖3 黃芪和哮喘共同靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析結果

將上述81 個潛在靶點經R 語言運行后可得到GO 功能富集分析110 個條目（P ＜0.05），按照P 值從小到大順序排列，排名前20 的GO 條目繪制成氣泡圖，氣泡節點越大則富集基因數目越多，顏色越紅則富集越顯著，見圖4（封三），其中在DNA 結合轉錄因子結合、DNA 結合轉錄激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結合、氧化還原酶活性、激活轉錄因子結合等方面靶點富集較集中。

圖4 基因本體論功能富集分析

KEGG 通路富集分析篩選得到119 條通路（P ＜0.05），按照P 值從小到大順序排列，排名前20 的通路繪制成柱狀圖，柱狀圖長度越長則富集基因數目越多，顏色越紅則富集越顯著，見圖5（封四），其中黃芪治療哮喘的主要信號通路為AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和p53 信號通路。

圖5 日本京都基因和基因組百科全書通路富集分析

3 討論

本研究篩選出黃芪治療哮喘的主要活性成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮。其中槲皮素可以通過抑制氣道炎癥、降低氣道高反應性和免疫調節等多種途徑對哮喘起到明顯的治療作用。Luo 等[8]研究發現槲皮素可以通過抑制IL-6、IL-1β和TNF-α 等炎癥因子的表達減輕氣道炎癥反應，緩解哮喘小鼠的癥狀。山柰酚可以抑制哮喘氣道重塑重要靶點轉化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA 的表達[9]。異鼠李素能夠通過抑制樹突細胞（DCs）表面共刺激分子的表達調節機體免疫能力和減輕炎癥反應[10]。刺芒柄花素可以減輕炎癥反應、抗氧化及調節免疫機制，能夠通過促進相關免疫器官免疫活性細胞的增殖和成熟來增強機體的免疫功能[11]。毛蕊異黃酮可以抑制過敏性炎癥的早期反應，其機制可能與降低核因子κB（NF-κB）轉錄活性，進而減少胸腺基質淋巴細胞生成素的生成有關[12]。由此可見黃芪中的主要活性成分具有抗炎、抗氧化、免疫調節等功能，對哮喘引發的炎癥反應及氣道重塑具有潛在的治療作用。

通過PPI 網絡分析篩選degree 值前6 位的靶點依次為：MAPK8、EGFR、IL-6、Cyclin D1、VEGF、MYC，可能為黃芪發揮中醫臨床功效及與哮喘產生關聯的關鍵作用靶點。MAPK8 是MAPK 家族成員之一，MAPK 信號通路可以通過介導炎癥、免疫應答、氣道結構細胞反應等途徑參與哮喘的發生和發展[13]。EGFR 能夠與表皮生長因子、轉化生長因子等配體結合，促進上皮細胞和成纖維細胞的增殖、分化，從而致使氣道上皮組織損傷和氣道重塑，加重哮喘的病情[14]。IL-6 是哮喘的重要促炎性細胞因子，能夠刺激Th2 細胞、嗜酸性粒細胞等釋放多種炎癥介質，誘發哮喘患者氣道炎癥，加重哮喘癥狀[15]。VEGF 能夠刺激血管內皮細胞增殖，促進氣道血管擴張和通透性增強，促使支氣管周圍纖維化，加重哮喘氣道重塑[16]。研究證實，Cyclin D1 和MYC 基因均能夠促進氣道平滑肌細胞的增殖力，兩者在哮喘大鼠肺組織中的表達水平與氣道重塑程度呈正相關[17-18]。

GO 功能富集分析發現，黃芪治療哮喘的潛在靶點主要涉及DNA 和RNA 的轉錄調控、細胞因子與轉錄因子的活性及受體結合、抗氧化應激、激素調節、蛋白質結合和酶活性等生物學功能。通過KEGG 富集分析并查閱文獻發現黃芪可以通過調控多條信號通路達到治療哮喘的目的。其中AGE-RAGE 信號通路能夠磷酸化NF-κB，促進大量黏附分子、生長因子、炎癥細胞因子的表達和釋放，引發氣道炎癥反應[19]。AGE-RAGE 信號通路可以通過激活蛋白激酶C 增強TGF-β1 的表達，致細胞外基質的沉積及氣道上皮間質化，最終導致氣道重塑[20-21]。TNF 信號通路是哮喘發病過程中的重要通路，能夠促使中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等多種炎癥細胞聚集于氣道產生炎癥反應，調控支氣管平滑肌細胞增殖分化和增加血管通透性參與氣道重塑，并刺激G 蛋白偶聯受體、內皮素受體的表達引發氣道高反應性[22]。PI3K/Akt 信號通路與哮喘氣道重塑關系密切，可促進氣道平滑肌細胞增殖，造成氣道壁增厚和管腔狹窄[23]。研究發現，PI3K/Akt 信號通路可調控Th1/Th2，促進Th2 細胞炎癥因子的分泌，引發哮喘的氣道炎癥反應及氣道高反應性[24]。嗜酸性粒細胞的凋亡過程主要由細胞抗凋亡基因（Bcl 基因家族）調控，p53 信號通路可以激活線粒體上的Bax 基因，使其與Bcl-2 結合而解除Bcl-2 抑制細胞凋亡的作用，從而誘導嗜酸性粒細胞凋亡，控制哮喘的炎癥反應[25]。以上的研究結果與本研究的網絡藥理學預測結果較為一致，進一步印證了黃芪治療哮喘的作用機制。

綜上所述，黃芪的主要活性成分可通過多靶點、多通路發揮對哮喘的治療作用。黃芪中槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮通過調控AGERAGE 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和p53 信號通路作用于MAPK8、EGFR、IL-6、Cyclin D1、VEGF、MYC 等靶點，發揮抗炎、抗氧化、免疫調節等作用，對哮喘所引發的炎癥反應、氣道高反應性及氣道重塑發揮治療作用。鑒于本研究僅是通過數據挖掘的形式對黃芪治療哮喘的作用機制進行預測，數據庫尚未能收錄所有的化學成分，可能會造成部分特異性化合物信息丟失，故存在一定的局限性，后期還需要更加深入的基礎實驗和臨床試驗予以佐證。