NLRP3 的過度激活與ARDS和損傷性機械通氣誘導的肺損傷的關系

劉 軍 石 穎 王婷婷 左祥榮

南京醫科大學第一附屬醫院重癥醫學科，江蘇南京 210029

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是急性彌漫性損傷導致的急性缺氧性呼吸衰竭。在全世界，每年約有300 萬ARDS 患者，占重癥監護病房住院人數的10%[1-2]，院內死亡率仍然高達46.1%[3]。機械通氣是ARDS 的有效治療手段之一，但它是一把“雙刃劍”，可能會導致呼吸機相關性肺損傷（VILI）[4-5]。機械牽張刺激肺泡上皮細胞，激活肺泡巨噬細胞等炎癥細胞，釋放大量炎性因子，導致失控性“瀑布樣”炎癥反應[6]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體的是一種由傳感器蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC 和效應蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）-1 組成多蛋白復合物，可被病原體相關分子模式或損傷相關分子模式激活，如細菌、病毒和ATP 等[7-9]。NLRP3 過度激活也會導致組織損傷和器官功能障礙[10]。研究表明NLRP3炎癥小體在ARDS 或VILI 中發揮了重要作用[11-13]。但既往研究通常使用40 mL/kg 的潮氣量誘導肺損傷，遠超過臨床常用量[6]。在動物模型中，20 mL/kg 是造成肺損傷較為合適的潮氣量[14]。本研究擬以潮氣量為20 mL/kg 來模擬損傷性機械通氣，探討NLRP3 過度激活是否參與ARDS 和損傷性機械通氣誘導的肺損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及ARDS 模型的制備

清潔級雄性SD 成年大鼠50 只，體重（330±20）g，購于南京醫科大學實驗動物中心[SCXK（蘇）2016-0002]。飼養于南京醫科大學動物中心，飼養溫度（23±2）℃，濕度（40±5）%，普食飼養，自由飲水。本研究經過南京醫科大學動物倫理委員會批準（審批號：IACUC-1905030）。取10 只SD 大鼠按隨機數字表法分為生理鹽水（NS）組和油酸（OA）組。OA 組頸靜脈注入OA（0.1 mL/kg）制備ARDS 模型[15-16]，NS 組注入等量生理鹽水。2 h 后通過氧合指數，肺損傷評分和肺濕干重比（W/D），確定造模成功。

1.2 實驗分組及處置

另取40 只大鼠按隨機數字表法分為對照組（n=10）、OA 組（n=30）。大鼠麻醉后行氣管切開插管，2 h后開始機械通氣，OA 組按通氣方式不同分為ARDS組、小潮氣量組（Vt=6 mL/kg）、損傷性通氣組（Vt=20 mL/kg）。對照組和ARDS 組大鼠保留自主呼吸。其余兩組機械通氣4 h（吸入氧濃度為21%，呼吸頻率為80 次/min，吸呼比為1∶2）。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 血氣分析 將大鼠麻醉（腹腔注射2%戊巴比妥鈉），經左頸動脈置管并固定。在麻醉后2、3、4、5 h 和6 h 采集左頸動脈血行血氣分析，記錄pH 值、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、并根據測得氧分壓和吸入氧濃度計算氧合指數。

1.3.2 肺濕/干重比（W/D）及肺病理學損傷評分 頸椎脫位法處死大鼠取右肺稱濕重，隨后在60℃的烤箱中干燥72 h 稱干重，計算W/D。分離出左肺洗滌后用4%多聚甲醛固定，HE 染色。按隨機雙盲原則，由3 名病理醫師按美國胸科學會的肺損傷評分標準[17]進行評分。

1.3.3 Western blot 取肺組織加入裂解液（含蛋白酶和酸酶抑制劑）提取總蛋白。采用BCA 試劑盒（碧云天，中國，P0010）測定總蛋白濃度。取等量蛋白質（30 μg）進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上。用5%的脫脂牛奶進行封閉2 h，4℃一抗孵育過夜。所用一抗如下：NLRP3（1∶1000 Abcam UK，ab263899），Caspase-1（1∶1000 Invitrogen USA，MA5-32137），IL-1β（1∶3000 Abcam UK，ab9787），IL-18（1∶3000 Abcam UK，ab191860），and GAPDH（1∶1000 Cell Signaling Technology USA，97166S）。洗滌后，膜與二抗（1∶1000，碧云天，中國，A0208）室溫下孵育1 h。ECL 發光液處理Western blot 條帶后，使用GelDox XR系統（Bio-Rad，CA，USA）成像。

1.3.4 RT-PCR 檢測NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 的mRNA 表達 從肺組織中提取總RNA，反轉錄合成cDNA。RT-PCR 擴增cDNA 反應體系為25 μL（2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol/L 基因引物2.0 μL，反轉錄產物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL），擴增條件：95℃熱啟動10 min 后；95℃30 s，58℃退火延伸30 s，共40 循環。每份樣本重復檢測3 次，取平均Ct 值，用相對定量法（2-△△Ct）計算各組小鼠目的基因表達。引物序列如下：NLRP3 正向引物為5’-CAGACCTCCAAGACCACGACTG-3’，反向引物為5’-CATCCGCAGCCAATGAACAGAG-3’。Caspase-1 正向引物為5’-ACTGAACAAAGAAGGTGGCG-3’，反向引物為5’-CAAGACGTGTACGAGTGGGTG-3’。IL-18 正向引物為5’-GACTGGCTGTGACCCTATCTGTGA-3’，反向引物為5’-TTGTGTCCTGGCACACGTTTC-3’。IL-1β 正向引物為5’-CTGTGACTCGTGGGATGATG-3’，反向引物為5’-AGGGATTTTGTCGTTGCTTG-3’。GAPDH 正向引物為5’-TGCCGCCTGGAGAAACCTGC-3’，反向引物為5’-TGCCGCCTGGAGAAACCTGC-3’。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t。兩組比較采用t 檢驗。重復測量數據采用雙因素重復測量方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARDS 模型判定

注入OA 2 h 后，OA 組氧合指數低于NS 組，肺損傷評分、W/D 比高于NS 組（P ＜0.01），見表1。肺組織HE 染色可見OA 組大鼠肺泡腔內有淡紅色均質狀水腫液滲出，肺泡間隔增厚，紅細胞及中性粒細胞浸潤，見圖1。

圖1 OA 注射2 h 后兩組大鼠肺組織病理變化（HE，200×）

表1 油酸注射2 h 后兩組大鼠氧合指數、肺損傷評分、W/D 比較（）

表1 油酸注射2 h 后兩組大鼠氧合指數、肺損傷評分、W/D 比較（）

注：NS：生理鹽水；OA：油酸；W/D：肺濕/干重比。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 各組大鼠血氣參數和肺損傷

整體分析發現，麻醉后2、6 h，ARDS 組pH 和氧合指數均低于對照組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），見圖2A。麻醉后6 h，損傷性機械通氣組pH和氧合指數低于ARDS 組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），圖2A。麻醉后6 h，小潮氣量組氧合指數和pH 高于ARDS 組（P ＜0.05），見圖2A。整體分析發現，麻醉后2 h PaCO2組間比較，差異無統計學意義（均P ＞0.05），見圖2A。麻醉后6 h，小潮氣量組PaCO2高于ARDS 組，ARDS 組PaCO2高于對照組和損傷性通氣組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），見圖2A。麻醉后6 h，ARDS 組肺損傷評分和W/D 高于對照組；損傷性通氣組高于ARDS 組，小潮氣量組低于ARDS 組（均P ＜0.001），見表2。

表2 各組大鼠肺損傷評分及W/D 比較（）

表2 各組大鼠肺損傷評分及W/D 比較（）

注：與對照組比較，aP ＜0.01；與ARDS 組比較，bP ＜0.01；與小潮氣量組比較，cP ＜0.01。ARDS：急性呼吸窘迫綜合征；W/D：肺濕干重比

圖2 各組大鼠血氣參數及肺組織HE 染色（200×）

2.3 各組大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 表達

ARDS 組NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 蛋白表達高于對照組；損傷性通氣組高于ARDS 組；而小潮氣量組和ARDS 組比較，差異無統計學意義（P >0.05）。見圖3。ARDS 組NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β mRNA 的表達高于對照組（P ＜0.05）。損傷性通氣組高于ARDS 組（P ＜0.05），而小潮氣量組與ARDS組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β 相對表達量比較（）

表3 各組大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β 相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與ARDS 組比較，bP ＜0.05；與小潮氣量組比較，cP ＜0.05。NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；Caspase-1：天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1；IL-18：白細胞介素18；IL-1β：白細胞介素1β；ARDS：急性呼吸窘迫綜合征

圖3 蛋白質免疫印跡試驗檢測各組大鼠肺泡巨噬細胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-18 的蛋白表達

3 討論

本研究通過右側頸靜脈注射OA 成功制備了ARDS 模型[18]。本研究結果顯示損傷性機械通氣和ARDS 均可使肺組 織中NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 表達增加，并且上述指標的高表達與肺損傷具有相關性。

NLRP3 炎癥小體通過活化Caspase-1，促使pro-IL-β 和pro-IL-18 裂解、成熟、釋放，參與先天免疫防御，是機體固有免疫系統的重要組成部分[19]?；钚匝酰≧OS）是激活NLRP3 的重要途徑，ARDS 會使內皮細胞/上皮細胞功能受損產生過多的ROS[20-21]。本研究中，ARDS 組肺組織中NLRP3 表達高于對照組，并且Caspase-1 活化表達增加，其下游的IL-1β、IL-18 表達也增加，提示ARDS 可誘導NLRP3 活化。另外，損傷性機械通氣可以提高肺泡巨噬細胞中ROS 的表達水平[22]，機械牽張也會直接激活肺泡巨噬細胞中的NLRP3[23]。本研究提示損傷性通氣組的NLRP3 表達水平高于ARDS 組，并且肺損傷更嚴重。這可能是因為損傷性通氣導致NLRP3 過度激活，引起由炎性介質、細胞因子和炎癥細胞參與的生物損傷。而小潮氣量組肺損傷較輕，可能與改善氧合抑制ROS 產生，減少對肺的過度牽張有關。這些結果提示損傷性通氣和ARDS 都可激活肺組織中的NLRP3，并且損傷性機械通氣NLRP3 過度激活。一旦NLRP3 被激活會導致Casepase-1、IL-1β、IL-18 表達升高。IL-1β 在急性肺損傷的發展中起著關鍵作用，可促使轉化生長因子-β表達增加，后者是炎癥和纖維化的標志[24]。有研究提示急性肺損傷的病癥嚴重程度與IL-18 水平有直接關聯[25]。Western blot 及RT-PCR 證實，與ARDS 組相比，損傷性通氣組IL-1β、IL-18 的表達水平更高，病理分析提示肺損傷更嚴重。這就提示損傷性通氣使NLRP3 過渡激活，釋放大量炎癥因子，加重了ARDS肺損傷。

綜上所述，NLRP3 炎癥小體激活與ARDS 所致肺損傷相關。在ARDS 基礎上，損傷性通氣進一步增加了NLRP3 及其下游炎癥因子IL-1β、IL-18 的表達，提示損傷性通氣可能通過過度激活NLRP3 加重ARDS 大鼠肺損傷，而小潮氣量通氣可以避免過度激活NLRP3炎癥小體，可能是其發揮肺保護作用的機制之一。