不同前列腺特異性抗原檢測方法在前列腺癌根治術后隨訪中的應用

韓志峰，谷費菲，劉 晨，丁文潔

1.中國人民解放軍東部戰區總醫院普通外科實驗室，江蘇南京 210002；2.中國人民解放軍東部戰區空軍醫院檢驗科，江蘇南京 210000

在接受前列腺癌根治術的患者中，術后10年復發率高達17.00%～53.00%，且大部分患者復發時多處于術后2～3年[1-2]。血清前列腺特異性抗原(PSA)是前列腺癌診斷的常用標記物之一，在早期前列腺癌患者行前列腺癌根治術后，若血清PSA水平降低至谷底(最低值)后連續2次上升>0.2 ng/mL，則定義為生化復發[3]。生化復發要比臨床癥狀更早出現，且生化復發后的數月甚至數年才能通過影像學發現病灶，因此生化復發常被作為前列腺癌復發的最佳早期預測指標[4]。此外，術后隨訪中基于PSA水平的增高進行干預，較臨床復發后干預更有助于改善患者的無癌生存率及預后。但目前常規PSA檢測存在一定弊端，前列腺癌根治術后有相當一部分血清PSA濃度<1 pg/mL的患者未被檢測到[5-6]。本研究探討了超敏PSA免疫分析測定法在前列腺癌根治術后隨訪中應用的可行性，以及現代超靈敏檢測技術是否可以提高此類患者的PSA監測水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 將于中國人民解放軍東部戰區總醫院或東部戰區空軍醫院行前列腺癌根治術的20例術后患者的血清樣本進行研究。納入標準：(1)符合早期前列腺癌診斷標準及前列腺癌根治術適應證[7]；(2)術后PSA濃度均<100 pg/mL；(3)患者知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并免疫性疾病或免疫缺陷；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并肝、腎功能不全等機體重要器官損害；(4)術后隨訪時間<2年，且連續收集血清次數<4次。入選患者均為男性，年齡51～72歲，中位年齡60歲。每例患者在5個術后隨訪時間點收集血清樣本，隨訪時間點的術后平均天數分別為79 d、302 d、616 d、810 d、1 021 d以及1 293 d，在中位隨訪時間3.5年內(范圍2～6年)共收集了100個樣本，樣本檢測前均置于-80 ℃的環境中存放?；颊叽_診時年齡、術前PSA水平等基本情況見表1。

表1 20例前列腺癌根治術患者的基本情況

1.2方法 分別采用酶聯免疫吸附法(ELISA)與超敏PSA檢測法測定患者術后不同時間的PSA水平。

1.2.1ELISA法 采用上海信帆生物公司生產的人PSA試劑盒，嚴格按照說明書對同一組縱向樣本中的PSA水平進行檢測，PSA水平為總PSA水平，包括了血清游離PSA和與α1-抗胰凝乳蛋白酶結合的PSA。所有的血清樣本均與8個校準品一式三份進行測量，來自同一患者的系列樣品在同一微孔板中運行，以最大程度地減少技術差異。

1.2.2超敏PSA檢測法 采用基于電化學發光法的MesoScale Discovery來檢測血清中的復合PSA，試劑盒為羅氏公司生產的總PSA定量測定試劑盒，并嚴格按照說明書操作，來自同一患者的系列樣品在同一微孔板中運行，以最大程度地減少技術差異。

1.3統計學處理 采用Pearson相關性系數分析超敏PSA檢測法的精度和準確性，兩種檢測方法對生化復發的術后診斷時間差異采用Mann-Whitney檢驗，二分型的組織病理學資料比較采用Fisher精確檢驗，其余如年齡、術前PSA及Gleason評分等的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1超敏PSA檢測法的可靠性 采用超敏PSA檢測法成功對100個樣本的PSA水平進行了定量分析，檢測下限(LLD)為0.003 pg/mL，重復測量的樣本之間具有極強的相關性(r=0.99，P<0.01)。同時，96個(96.00%)重復測量樣本的批內精密度相對標準偏差(CV)<10.00%，PSA濃度范圍為0.084～119.021 pg/mL，見圖1A。此外，使用ELISA僅在38個樣本中檢測到了PSA，LLD為1 pg/mL，超敏PSA檢測法測得的對應樣本的PSA濃度與其具有極強的相關性(r=0.91,P<0.01)，見圖1B。

圖1 超敏PSA檢測的可靠性散點圖分布情況

2.2兩種方法對血清PSA的縱向監測情況 使用ELISA法檢測20例患者中有7例符合生化復發標準[3]，見圖2A。另外13例患者血清PSA未顯示連續的增高，其中有7例患者在所有隨訪時間點的PSA濃度無法測出，見圖2B。而超敏PSA檢測法檢測20例患者中有8例符合生化復發標準，見圖3A。另外12例患者血清PSA未顯示連續的增高，見圖3B。超敏PSA檢測法術后診斷生化復發的時間中位數為948 d，ELISA法為1 015 d，兩者差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 ELISA法檢測的血清PSA的縱向變化曲線

圖3 超敏PSA檢測的血清PSA的縱向變化曲線

2.3兩種檢測方法診斷生化復發與未復發患者的臨床和病例學特征比較 兩種檢測方法診斷為生化復發患者的Gleason評分均明顯高于未復發組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖4。其余如年齡、術前PSA、精囊受累、周圍組織浸潤等臨床和病例學特征差異均無統計學意義(均P<0.05)。

注：有2例患者資料缺失，A為ELISA法，B為超敏PSA檢測法。

3 討 論

PSA監測是前列腺癌根治術后生化復發的重要判斷工具，在關鍵時期開始實施挽救治療能最大程度改善預后。但很多患者的術后PSA采用常規ELISA法無法檢測到，PSA“缺失”可能長達數月或者數年，漏診的可能性較大[8-9]。隨著超敏PSA檢測技術的出現，大大提高了檢測靈敏度，但應充分分析因其帶來的優勢及風險，以確保臨床決策基于可靠且有意義的實驗室結果，并避免反復發作的過度診斷和過度治療。

MesoScale人復合PSA檢測法的LLD為0.003 5 pg/mL，是迄今為止報道最靈敏的PSA檢測方法之一，可與之比較的超敏PSA技術包括基于金納米顆粒、單分子陣列和基于超順磁珠的陣列測定(LLD 0.003～0.05 pg/mL)[10-12]。SCHUBERT等[11]報道，采用單分子陣列技術發現血清PSA水平>0.05 pg/mL時CV<20.00%，而PSA在1～50 pg/mL時則CV<10.00%，可見采用超敏PSA檢測法的精度更好。而本研究采用超敏PSA檢測法結果發現重復測量的樣本之間具有極強的相關性，測定PSA濃度最低值為0.084 pg/mL，而且測定的內變異性較低、精度較高(96.00%的樣本CV<10.00%)，與既往采用ELISA法重復測定未經稀釋血清樣品CV值<10.40%的報道一致[13]。在前列腺癌之外，眾所周知女性血清中PSA濃度較低(<1 pg/mL)，因此超敏PSA檢測還有望滿足各種醫學背景下女性PSA水平的監測需求。

為了進一步探尋低濃度(<1 pg/mL)的PSA動力學是否能夠為生化復發提供臨床指導，本研究發現使用ELISA法監測(LLD為1 pg/mL)時，有80.00%的前列腺癌患者在根治術后第1時間點均顯示PSA缺失，這些患者中有一半以上在術后約1～2年的隨訪中可檢測到PSA增加。同時，考慮到由于許多復發性前列腺癌病例會在2年內出現[14]，因此在此期間監測當前無法檢測到的PSA理論上可以早期檢測某些患者的生化復發。此外，既往一項為期5年的隨訪研究表明[15]，ELISA分析靈敏度的提高使得生化復發的檢測時間比傳統分析方法早了18個月。而本研究結果則提示，超敏PSA檢測法盡管其靈敏度提高到了0.003 pg/mL，但與ELISA檢測術后生化復發的時間比較差異無統計學意義(P>0.05)，與前述報道并不一致，也可能與本研究的樣本量有關。

本研究采用超敏PSA檢測法在0.003～1 pg/mL范圍內檢測PSA水平時，根據ELISA法評估為無生化復發的前列腺癌根治術患者中有1例(5.00%)符合生化復發標準，該例患者(P7)的所有血清樣本在使用ELISA法測定時均檢測不到PSA，而超敏PSA檢測法在術后第2個隨訪時間點(術后250 d)至最后一個隨訪時間點(術后1 297 d)的PSA測量值出現了穩定升高，從0.32 pg/mL上升到4.40 pg/mL(圖3A)。說明單個患者在2.9年中的PSA增加了14倍，因為相當低的PSA濃度，基于此信息的臨床行動應保持懷疑態度。筆者建議仍然使用ELISA法監測的臨床價值更高。

本研究結果還提示，患者之間和患者內部PSA在<2 pg/mL時存在的較大幅度變化，這可能是由于生物學(日常)變化，例如分泌非前列腺組織的PSA。此外，有3例無生化復發的患者(P11、P16及P17)，PSA動力學在<2 pg/mL的低水平下存在很大的不確定性，他們從最低點連續出現了2次PSA升高，總體升高幅度極大，然后在隨后的時間點該值急劇下降(圖3B)。很明顯，在如此低的濃度(<2 pg/mL)下PSA的變化可能不夠可靠，無法預測生化復發的征兆或觸發臨床決策。一項基于納米顆粒生物條形碼PSA分析(LLD為0.33 pg/mL)的研究報道發現[16]，<5 pg/mL的變化不能預測前列腺癌復發，而PSA單調升高>5 pg/mL則可預測生化復發。結合本研究結果提示，ELISA檢測的性能似乎足以指導臨床操作。

將臨床病理信息與PSA監測相結合對前列腺癌根治術后生化復發的監測具有重要意義。PSA濃度升高至標準閾值200 pg/mL以下僅可預測Gleason評分>8分、精囊浸潤、手術切緣陽性及前列腺外擴張等高危因素患者的復發[17]。而歐洲泌尿外科協會的新前列腺癌指南將復發的最主要不利預后因素確定為Gleason評分為8～10分，PSA倍增時間<1年[18]。本研究發現Gleason評分較高與生化復發狀態相關，但與其他高風險因素之間沒有關系。可能歸因于本研究中包括的患者數量較少。

綜上所述，本研究超敏PSA檢測法能夠跟蹤血清PSA 0.003 5～1 pg/mL范圍內的微小變化，比ELISA法靈敏度高，且對超敏PSA工具的技術實用性提供了全面報告。但在PSA低濃度下監測可能會導致前列腺癌根治術后生化復發結果不可靠，還是建議采用ELISA法進行前列腺癌根治術后PSA的隨訪檢測。