囊型包蟲病所致過敏反應(yīng)對腸黏膜屏障功能的影響

商海波 李 鑫 劉可可 王 江

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，新疆烏魯木齊 830054

包蟲病是一種流行于牧區(qū)的人畜共患性疾病，在手術(shù)切除或外傷等外力作用下極易引起囊液外溢，經(jīng)腹膜或組織吸收入血或直接入血后發(fā)生過敏反應(yīng)，且極易發(fā)生過敏性休克，給臨床治療帶來了極大困難[1]。腸黏膜屏障是一種存在于腸道內(nèi)防止有害物質(zhì)進入的生物屏障[2]。在腸腔中存在著大量的有害物質(zhì)，完整的腸上皮屏障可阻止?jié)撛谟泻ξ镔|(zhì)的通過，在體內(nèi)平衡中起著重要作用[3]。有學者表示，腸黏膜屏障受損后細菌、內(nèi)毒素等進入循環(huán)和淋巴系統(tǒng)是引起炎癥介質(zhì)大量表達和全身炎癥反應(yīng)綜合征的始動環(huán)節(jié)[4]。燒傷、急性創(chuàng)傷、中暑、應(yīng)激等多種病理過程可對腸黏膜造成損傷[5]。研究表明，細胞因子白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子kappa B-p65（phosphorylated nucler factor of kappa B-p65，p-NF-κBp65）可直接對腸黏膜產(chǎn)生損傷，在胰腺炎、創(chuàng)傷等引起的腸損傷中具有重要作用[6-7]。本研究通過了解包蟲病所致過敏反應(yīng)對包蟲病小鼠腸黏膜屏障的影響，探索用于包蟲病過敏患者的更完備的診療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實驗試劑：小鼠D-乳酸試劑盒（型號：MAK058 sigma 公司）；二胺氧化酶（diamine oxidase DAO）試劑盒（型號：CSB-E10090M，武漢華美公司）；IL-6 和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（型號：EK206/3-96，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；Western blot 相關(guān)試劑盒（Sangon Biotech 公司）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（貨號：MK1020，武漢博士德公司）；BCA 試劑盒（貨號：DQ111-01，全式金公司）。

儀器：酶標儀（型號：xMark，TMBio-Rad 公司）；微量移液器（型號：單道移液器，大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：DNP-9272，上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；微量振蕩器（型號：MM-2，金壇市醫(yī)療儀器廠）；恒溫鼓風干燥箱（型號：DHG 型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；顯微鏡（型號：E200，Nikon生物顯微鏡）。

1.2 動物模型與分組

實驗小鼠：6～8 周齡的雌性BALB/c 小鼠45 只，購自新疆醫(yī)科大學[SYXK（新）2016-0002]，體重18～22 g，SPF 級，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，保持溫度18～22℃，相對濕度50%～60%，由專人飼養(yǎng)，提供潔凈的生存環(huán)境、優(yōu)質(zhì)顆粒飼料、清潔的自來水。新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準通過此飼養(yǎng)及實驗設(shè)計方案（IACUC20170315-04），所有實驗操作遵循實驗動物保護規(guī)定。采用隨機數(shù)字表法將小鼠分成空白對照組、囊型包蟲病模型組、囊型包蟲病致敏組，每組各15 只。由烏魯木齊市屠宰場抽取羊包蟲囊液，獲得幼蟲微囊，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組小鼠分別經(jīng)腹腔注射細粒棘球絳蟲的幼蟲微囊，每只小鼠接種約50 個微囊的劑量，建立包蟲小鼠模型，空白對照組給予等量生理鹽水代替。所有小鼠均飼養(yǎng)3 個月，取血后剖開小鼠腹腔，觀察到腹腔內(nèi)存在包蟲囊泡時認為囊型包蟲病小鼠模型創(chuàng)建成功；創(chuàng)建包蟲病模型小鼠3 個月后建立包蟲過敏模型，囊型包蟲病致敏組每只小鼠經(jīng)腹部注射羊源細粒棘球蚴包蟲囊液約0.1 mL/10 g 引發(fā)過敏反應(yīng)，空白對照組和囊型包蟲病模型組每只小鼠注射生理鹽水0.1 mL/10 g[8]。

觀察過敏反應(yīng)：激發(fā)過敏反應(yīng)后，觀察小鼠過敏反應(yīng)情況，當出現(xiàn)抓鼻、噴嚏、瘙癢時認為小鼠發(fā)生過敏反應(yīng)，抓鼻和瘙癢為輕度過敏；對外部刺激反應(yīng)減弱，活動減少為中度過敏；紫紺、抽搐或死亡為重度過敏，觀察時間約為1 h；同時采用馬血清導致小鼠過敏性休克反應(yīng)癥狀評分表對小鼠過敏癥狀進行評分[9]。0 分為無癥狀；1 分為反復(fù)抓、搔嘴或耳朵或后退撓耳；2 分為活動減少，自我孤立，眼周、口周水腫；3 分為靜止不動超過1 min；4 分為刺激胡須無反應(yīng)；5 分為震顫、抽搐、死亡。

1.3 樣本采集

觀察結(jié)束后，采用摘眼球取血法留取血標本，隨后麻醉小鼠，開腹觀察包蟲生長情況并留取腸組織標本。將采集到的血標本，在室溫下，以3000 r/min（離心半徑為30 cm）離心10 min 后，取上層血清裝于EP管中，并凍存在-80℃冰箱中。打開腹腔，截取距盲腸5 cm 處遠端回腸組織，置于液氮速凍后存于-80℃，用于檢測組織中TNF-α 和IL-6 的含量。另留取部分腸組織，置10%甲醛中固定48 h，行病理學觀察。

1.4 小腸組織學觀察

取各組小鼠的回腸組織，置于10%甲醛中固定24 h，進行石蠟切片、行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光鏡下觀察比較各組腸黏膜組織病理學變化。

1.5 血漿D-乳酸和DAO 含量的檢測

使用sigma 公司試劑盒（貨號：MAK058）測定血漿D-乳酸和DAO 含量，將三組小鼠稀釋后的血漿和標準品分別加入酶標板中，經(jīng)過孵育、洗滌等過程后，用酶標儀在450 nm 波長下依序測量各孔的光密度，計算其含量，實驗重復(fù)操作3 次，具體按說明書操作。

1.6 腸組織TNF-α 和IL-6 的測定

將三組小鼠腸組織樣本與冷的生理鹽水按照1∶9的比例混合，加入置于冰上的玻璃勻漿器中勻漿，取勻漿液于室溫下，以3000 r/min（離心半徑為30 cm）離心15 min，取上清液，應(yīng)用聯(lián)科生物公司ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-6 和DAO 濃度，實驗重復(fù)操作3 次，嚴格按說明書操作。

1.7 腸黏膜上皮細胞凋亡的檢測

取三組小鼠回腸組織石蠟包埋切片，使用武漢博士德公司TUNEL 凋亡檢測試劑盒（貨號：MK1020），檢測凋亡率，實驗重復(fù)操作3 次，具體步驟按說明書操作。

1.8 Western blot 檢測回腸組織中磷酸化NF-κB p65蛋白水平

取三組小鼠回腸組織約100 mg，置于離心管中，加入400μLRIPA 裂解液，混勻后，于室溫下，以12000r/min（離心半徑為30 cm）離心15 min，收集上清液，獲取蛋白樣品，采用全式金公司BCA 法試劑盒（貨號：DQ111-01）測定蛋白濃度；然后取蛋白樣品，經(jīng)過煮沸、SDS-PAGE 電泳分離蛋白、使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，然后封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，TBST 洗3 次，用TBST 稀釋一抗（1∶800），4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，加入稀釋的二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，經(jīng)顯色等過程，最后使用ChemiScope mini 化學發(fā)光儀檢測、拍照，實驗重復(fù)操作3 次。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠模型建立情況

囊型包蟲病致敏組小鼠在腹腔注射粗制囊液后均出現(xiàn)不同程度的過敏反應(yīng)癥狀：其中4 只小鼠為輕度過敏，癥狀評分為1 分；11 只小鼠為中度過敏發(fā)應(yīng)，癥狀評分為2～3 分；無重度過敏反應(yīng)發(fā)生。空白對照組和囊型包蟲病模型組小鼠未見明顯的過敏反應(yīng)癥狀，取血后打開小鼠腹腔，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組小鼠腹腔內(nèi)均有不同程度的包蟲囊泡存在，證實造模成功。見圖1。

圖1 解剖小鼠證實囊型包蟲感染情況

2.2 腸黏膜組織學改變

鏡下觀察，空白對照組小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)大體正常，少量絨毛結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)少量慢性炎癥細胞侵入；囊型包蟲病致敏組回腸黏膜明顯萎縮，大量腸絨毛變短或斷裂，間質(zhì)較多急慢性炎癥細胞浸潤；與囊型包蟲病致敏組比較，囊型包蟲病模型組回腸黏膜萎縮、腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞較輕，慢性炎癥細胞浸潤減少。見圖2。

圖2 各組小鼠腸黏膜組織蘇木精-伊紅染色結(jié)構(gòu)

2.3 三組小鼠血漿中DAO 和D-乳酸水平比較

與空白對照組比較，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組DAO 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與囊型包蟲病模型組比較，囊型包蟲病致敏組DAO 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與空白對照組比較，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組D-乳酸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與囊型包蟲病模型組比較，囊型包蟲病致敏組D-乳酸含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組小鼠血漿中DAO 和D-乳酸水平比較（）

表1 三組小鼠血漿中DAO 和D-乳酸水平比較（）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05；與囊型包蟲病模型組比較，▲P ＜0.05。DAO：二胺氧化酶

2.4 三組小鼠腸組織中IL-6 和TNF-α 含量比較

與空白對照組比較，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組IL-6 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與囊型包蟲病模型組比較，囊型包蟲病致敏組IL-6 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與空白對照組比較，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組TNF-α 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與囊型包蟲病模型組比較，囊型包蟲病致敏組TNF-α 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 三組小鼠腸組織中IL-6 和TNF-α 的含量比較（pg/mL，）

表2 三組小鼠腸組織中IL-6 和TNF-α 的含量比較（pg/mL，）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05；與囊型包蟲病模型組比較，▲P ＜0.05。IL-6：白細胞介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α

2.5 三組小鼠腸黏膜上皮細胞凋亡率比較

顯微鏡下觀察三組小鼠回腸黏膜組織細胞凋亡情況，空白對照組與囊型包蟲病模型組腸黏膜上皮細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。與空白對照組和囊型包蟲病模型組比較，囊型包蟲病致敏組腸黏膜上皮細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表3、圖3。

圖3 三組小鼠腸黏膜上皮細胞凋亡檢測圖

表3 三組小鼠腸黏膜上皮細胞凋亡率比較（%，）

表3 三組小鼠腸黏膜上皮細胞凋亡率比較（%，）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05；與囊型包蟲病模型組比較，▲P ＜0.05

2.6 三組小鼠腸組織中p-NF-κBp65 蛋白水平比較

與空白對照組比較，囊型包蟲病模型組和囊型包蟲病致敏組的p-NF-κBp65 蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與囊型包蟲病模型組比較，囊型包蟲病致敏組p-NF-κBp65 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表4、圖4。

表4 三組小鼠腸組織中p-NF-κBp65 蛋白水平比較（）

表4 三組小鼠腸組織中p-NF-κBp65 蛋白水平比較（）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05；與囊型包蟲病模型組比較，▲P ＜0.05。p-NF-κBp65：磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子kappa B-p65

圖4 三組小鼠的p-NF-κB p65 蛋白表達

3 討論

腸道是機體重要的應(yīng)激場所，其屏障功能的紊亂有利于過度免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)展[10]。當過敏反應(yīng)、應(yīng)激、創(chuàng)傷等各種因素作用于機體后，刺激機體免疫系統(tǒng)生成多種炎癥介質(zhì)，對腸黏膜產(chǎn)生損傷；且過敏反應(yīng)中釋放的組胺和引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)可引起微循環(huán)灌注不足，導致腸黏膜上皮細胞功能障礙和過度凋亡，進而造成腸黏膜損傷、內(nèi)毒素和細菌移位，引起全身炎癥反應(yīng)，對患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生不良影響[11-12]。DAO 是一種存在于腸黏膜上層成熟絨毛細胞中的細胞內(nèi)酶。腸黏膜上皮細胞膜完整性受損時可導致DAO 釋放到細胞間質(zhì)和循環(huán)中，使得血漿和腸腔中DAO 水平升高，血液中DAO 含量的增長可間接地說明腸道上皮細胞的損傷[13]。D-乳酸是消化道內(nèi)細菌發(fā)酵的產(chǎn)物，當腸道因缺血或炎癥反應(yīng)等病理過程發(fā)生損傷時，腸黏膜完整性受損，通透性增加，腸腔中的D-乳酸通過屏障進入循環(huán)系統(tǒng)，使血漿中D-乳酸水平升高。因此，血漿中DAO 和D-乳酸的升高可反映腸黏膜屏障功能障礙，是黏膜屏障損傷的常用指標[14]。本研究中囊型包蟲病致敏組和囊型包蟲病模型組血漿中DAO 和D-乳酸相較空白對照組明顯升高，病理切片顯示黏膜損傷嚴重，說明囊型包蟲病致敏組和囊型包蟲病模型組腸黏膜發(fā)生了損傷。

研究顯示，在自然感染囊性包蟲病的綿羊中，細粒棘球蚴病可能減少SIgA 的分泌，影響腸黏膜的免疫屏障，使得腸黏膜損傷[15]。趙驍?shù)萚16]研究發(fā)現(xiàn)，在通過腹腔注射原頭蚴建立的囊型包蟲病小鼠模型中，小腸黏膜內(nèi)免疫反應(yīng)也可被激活，并產(chǎn)生IL-25 等細胞因子。因此在本研究中，囊型包蟲病模型組小鼠腸黏膜損傷和通透性增加可能與腸黏膜免疫屏障損傷及免疫反應(yīng)被激活有關(guān)。IL-6 是一種重要的細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)過度表達的IL-6 可以破壞細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)，致使黏膜上皮細胞功能紊亂，引起腸黏膜機械屏障的障礙。TNF-α 也可對腸黏膜產(chǎn)生損傷，其在介導腸黏膜屏障功能障礙的復(fù)雜反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[17-18]。TNF-α 誘導IL-1、IL-6 的基因表達，活化磷脂酶A2，致使花生四烯酸分解，產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，從而加重腸道炎癥反應(yīng)[19-23]。研究表明用TNF-α 處理24 h 可引起腸黏膜上皮細胞凋亡增多，通透性增加，使得腸黏膜產(chǎn)生損傷；使用TNF-α 阻斷劑處理后，腸黏膜損傷明顯減輕[24-25]。本研究中囊型包蟲病致敏組腸組織IL-6 和TNF-α 較空白對照組和囊型包蟲病模型組明顯升高，說明回腸組織發(fā)生了炎癥反應(yīng)，IL-6 和TNF-α 可能導致了腸黏膜損傷。

核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）是多種信號傳導途徑的共同通路和炎癥及免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子[26]。研究表明，重癥胰腺炎所致腸黏膜損傷可能是通過NF-κB 信號通路，調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達，導致腸黏膜損傷[27]。炎癥反應(yīng)初期，細胞受到刺激后產(chǎn)生的細胞因子及內(nèi)毒素可激活NF-κB，活化的NF-κB 可啟動促凋亡基因，使細胞凋亡不斷增多，使得腸黏膜上皮屏障損傷；抑制NF-κB 信號通路能產(chǎn)生腸缺血后的保護作用，維持腸黏膜屏障功能[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，囊型包蟲病模型組p-NF-κBp65 蛋白表達升高，而且囊型包蟲病致敏組p-NF-κBp65 蛋白表達進一步升高，提示NF-κB 信號通路可能參與了囊型包蟲病所致過敏反應(yīng)產(chǎn)生的腸黏膜屏障功能障礙。

本研究顯示囊型包蟲病所致過敏反應(yīng)可引起腸黏膜炎癥反應(yīng)，引起腸黏膜屏障功能障礙，囊型包蟲病致敏組腸組織中p-NF-κBp65、IL-6、TNF-α 也明顯升高，提示p-NF-κBp65、IL-6、TNF-α 在囊型包蟲病所致過敏反應(yīng)導致的腸黏膜損傷中可能扮演重要作用，這也將為今后囊型包蟲病過敏引起的腸黏膜損傷機制的研究奠定基礎(chǔ)。