潰瘍性結腸炎患者腸道菌群紊亂與Th17/ Treg 平衡及相關細胞因子的關系

葉 佳 朱梅萍 劉 暢

上海中醫藥大學附屬曙光醫院脾胃病科，上海 201203

炎癥性腸病（IBD）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，而潰瘍性結腸炎（UC）是IBD 常見類型，主要特點為結直腸黏膜彌漫、連續炎癥改變，病變主要局限于黏膜下層和大腸黏膜[1]。研究認為，免疫失衡在UC 發病中扮演重要角色，以抗炎與促炎因子間失衡為主要研究方向[2]。T 淋巴細胞為機體重要免疫細胞，研究發現T 淋巴細胞激活后可釋放多種血管活性物質和細胞因子，加重組織炎癥反應，促進UC 發生和發展[3]。輔助性T 細胞17（Th17）和調節性T 細胞（Treg）是新近發現的CD4+T 淋巴細胞亞群，在多種免疫性疾病發生、發展中Th17/Treg 失衡及相關細胞因子的異常表達發揮重要作用[4]。有研究證實，UC 的發生和發展不僅與免疫調節功能紊亂有關，還與腸道菌群紊亂有關，是免疫損傷重要激發因素[5]。本研究就探討UC 患者腸道菌群紊亂與Th17/Treg 平衡及相關細胞因子的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年7 月—2020 年7 月上海中醫藥大學附屬曙光醫院（以下簡稱“我院”）收治的30 例活動期UC（AUC）患者為AUC組，其中男14 例，女16 例；平均年齡（45.56±3.72）歲；1∶1 選取我院30 例緩解期UC（RUC）患者為RUC組，其中男15 例，女15 例；平均年齡（45.68±3.63）歲。納入標準：①經病理檢查確診，符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018 年，北京）》[6]中AUC、RUC 診斷標準；②患者及家屬均知情研究。排除標準：①妊娠及哺乳期婦女；②心、肝、腎功能損害；③近1 個月使用免疫抑制劑、激素、微生態制劑、抗生素；④完全性腸梗阻或不完全性腸梗阻。另選取同期30 名來我院體檢健康者為對照組，其中男16 名，女14 名；平均年齡（44.57±3.87）歲；三組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 腸道菌群數目檢測 分別留取三組自然排出糞便1 g，糞便基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司；貨號：D2700；規格：50T），反轉錄試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司；貨號：R2043；規格：20 μL×100T）轉錄合成cDNA，加入細菌基因組DNA 引物，引物序列見表1，實時定量聚合酶鏈反應擴增，根據擴增曲線計算細菌數目，以lg n/g 表示。

表1 腸道菌群引物序列

1.2.2 外周血Th17、Treg、Th17/Treg比值測定抽取三組3mL空腹外周靜脈血，密度梯度離心法獲取單個核細胞，各管加入CD8a-異硫氰酸熒光素、CD3-藻紅蛋白Cy5、白細胞介素（IL）-17 藻紅蛋白，室溫避光孵育30 min。加入100 μL 固定劑，孵育30 min，加入100 μL 破膜劑A，室溫孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，800 r/min 離心6 min（半徑13.5 min），收集細胞，加入100 μL破膜劑B 和IL-17 抗體，室溫孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，磷酸緩沖鹽溶液500 μL細胞重懸，貝克曼庫爾DxFLEX 流式細胞儀測定Th17 占比。再抽取三組3 mL 空腹外周靜脈血，加入10 μL CD127-藻紅蛋白-Cy5、CD25-Cy5、CD4-異硫氰酸熒光素，室溫孵育20 min，加入1 mL 溶血素，混勻后再加入磷酸緩沖鹽溶液2 mL，1500 r/min 離心5 min（半徑8 cm），棄上清，磷酸緩沖鹽溶液500 μL細胞重懸，貝克曼庫爾DxFLEX 流式細胞儀測定Treg 占比，并計算Th17/Treg 比值。

1.2.3 結腸黏膜組織中炎癥因子表達水平測定 石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精洗去二甲苯，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，使內部抗原決定簇暴露，3%過氧化氫浸泡10 min，封閉，加入稀釋一抗4℃孵育12 h，沖洗后加入二抗室溫孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次。二氨基聯苯胺作用4 min，去離子水終止，高倍鏡（400 倍）下取5 個視野，計算黏膜組織中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17 光密度值，以平均值為表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，計數資料以例數和百分率表示，采用χ2檢驗；Pearson 系數進行相關性分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組腸道菌群數目比較

AUC組腸球菌、腸桿菌數目明顯多于RUC組、對照組，且RUC組高于對照組（P ＜0.05）；AUC組擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數目明顯少于RUC組、對照組，且RUC組低于對照組（P ＜0.05）。見表2。

表2 三組腸道菌群數目比較（lg n/g，）

表2 三組腸道菌群數目比較（lg n/g，）

注：與對照組比較，ΔP ＜0.05；與RUC組比較，*P ＜0.05。UC：潰瘍性結腸炎

2.2 三組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比較

AUC組外周血Th17 細胞比例明顯高于RUC組、對照組，且RUC組高于對照組（P ＜0.05）；AUC組Treg 細胞比例和Th17/Treg 比值明顯低于RUC組、對照組，且RUC組低于對照組（P ＜0.05）。見表3。

表3 三組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比較（）

表3 三組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比較（）

注：與對照組比較，ΔP ＜0.001；與RUC組比較，*P ＜0.001。Th17：輔助性T 細胞17；Treg：調節性T 細胞；UC：潰瘍性結腸炎

2.3 三組結腸黏膜組織中炎癥因子表達水平比較

AUC組黏膜組織中IL-2、IL-6、IL-17 表達明顯高于RUC組、對照組，且RUC組高于對照組（P ＜0.05）；AUC組IL-10 表達明顯低于RUC組、對照組，且RUC組低于對照組（P ＜0.05）。見表4。

表4 三組結腸黏膜組織中炎癥因子表達水平比較（μm2，）

表4 三組結腸黏膜組織中炎癥因子表達水平比較（μm2，）

注：與對照組比較，ΔP ＜0.05；與RUC組比較，*P ＜0.05。IL：白細胞介素；UC：潰瘍性結腸炎

2.4 UC 患者外周血Th17、Treg 及炎癥因子與腸道菌群數目的相關性

Pearson 相關性分析顯示，UC 患者外周血Th17、IL-2、IL-6、IL-17 與腸球菌、腸桿菌呈正相關，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈負相關（P ＜0.05）；Treg、IL-10 與腸球菌、腸桿菌呈負相關，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈正相關（P ＜0.05）。見表5。

表5 UC 患者外周血Th17、Treg 及炎性因子與腸道菌群數目的相關性（n=60）

3 討論

UC 是消化系統疑難疾病，盡管目前UC 的確切病因不明，但近年有關免疫力和腸道菌群的研究興起，發現UC 患者腸壁內存在明顯過度免疫反應，引起腸道菌群抗原過度應答，導致消化道損傷，最終產生免疫損傷效應機制[7-13]。正常情況下，有超過500 種細菌定居于腸道，其中專性厭氧菌即生理性優勢菌占菌群總量的99%，其余兼性厭氧菌即條件致病菌占1%，繁殖處于相對抑制狀態[14-16]。Rosen 等[17]、Derikx 等[18]證實，UC 的發生與機體免疫和腸道菌群紊亂有關。Th17和Treg 為CD4+T 淋巴細胞亞群成員，其中Th17 表現為前炎性細胞亞類特征，Treg 表現為拮抗Th17 作用，二者細胞信號通路相互制約、交通，其平衡關系與機體免疫反應密切相關[19]。生理狀態下，T 淋巴細胞傾向Treg 分化，以維持機體免疫耐受，但若在感染、炎癥反應等病理狀態下，可激活免疫系統，使T 淋巴細胞傾向Th17 分化，引起機體對自身抗原免疫反應[20-21]。本研究結果顯示，三組外周血Treg 細胞比例逐漸降低，Th17 細胞比例和Th17/Treg 比值逐漸升高（P ＜0.05），提示UC 發生和發展有Th17/Treg 免疫失衡參與。結果顯示，Th17 與腸球菌、腸桿菌呈正相關，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈負相關（P ＜0.05）；Treg與腸球菌、腸桿菌呈負相關，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈正相關（P ＜0.05），兩者與腸道菌群間關系相反，進一步提示腸道菌群紊亂可能通過各種機制影響Th17/Treg 免疫平衡，進而參與UC 發生和發展。

Th17 細胞和Treg 細胞均為CD4+T 細胞亞群之一，Th17 細胞可分泌IL-2、IL-6、IL-17 等促炎細胞，能誘導炎癥反應，Treg 細胞可調節IL-10 等抗炎細胞，發揮負向免疫調節作用[22]。本研究結果顯示，三組黏膜組織中IL-2、IL-6、IL-17 表達逐漸升高，IL-10表達逐漸降低（P ＜0.05），提示免疫炎癥反應參與了UC 發生和發展。結果還顯示，IL-2、IL-6、IL-17 與腸球菌、腸桿菌呈正相關，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈負相關，IL-10 與腸球菌、腸桿菌呈負相關，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈正相關（P ＜0.05），推測腸道菌群紊亂可誘導Th17/Treg 免疫失衡，調節炎癥介質參與UC 發生和發展。但目前尚不明確腸道菌群紊亂影響Th17/Treg 免疫失衡的機制，可能與以下幾點有關。①腸道菌群可能通過基因直接影響能量代謝、分化方向等相關物理功能，影響Th17/Treg 平衡：如腸道菌群能作用于胸腺基質淋巴細胞生成素等受體，調控初始CD4+T 淋巴細胞向Th17 細胞或者Treg 細胞分化[23-24]。②腸道菌群可能通過能量代謝途徑影響Th17/Treg 平衡：如共生菌產生的三磷酸腺苷酶可直接激動小腸固有層CD11、CD70 細胞，促進CD4+T淋巴細胞向Th17 細胞分化，影響Th17/Treg 平衡，也可通過抑制1 型調節性T 細胞生成，破壞免疫耐受，增加Th17 細胞數目[25]。乳酸菌可上調碳水化合物代謝和轉運相關基因，當碳水化合物利用增加時，可增加參與葡萄糖和脂質代謝的短鏈脂肪酸含量，通過游離脂肪酸受體2 和3 通路增強免疫耐受，抑制免疫炎癥反應[26]。③腸道菌群可能通過細胞因子途徑影響Th17/Treg平衡：如分節絲狀菌能通過腸上皮細胞中樹突細胞抗原和淀粉樣蛋白A 促進CD4+T 淋巴細胞向Th17 細胞分化；同時樹突細胞可分泌IL-22，通過先天淋巴細胞通道增加IL-6、IL-22 分泌，增加淀粉樣蛋白A表達，促進向Th17 細胞分化[27-28]。

綜上所述，腸道菌群紊亂可能通過各種機制影響Th17/Treg 免疫平衡，調節炎癥介質分泌，參與UC 發生和發展。但本研究樣本量少，還需大樣本前瞻性研究證實。