MDR1、PEDF、LRP在宮頸癌中的表達及意義*

彭鈞，鮑方，李小月，王萬俊，開蕾，張二春

[1.安徽醫科大學附屬安慶醫院（安慶市立醫院）病理科，安徽安慶246003；2.安慶市第一人民醫院檢驗科，安徽安慶246003]

宮頸癌是女性第4 大常見惡性腫瘤，占全球女性癌癥死亡人數的7.5%，持續的人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染是宮頸癌發生的主要原因[1]。我國近年宮頸癌的發生率逐年升高，且呈年輕化趨勢[2-3]。多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1,MDR1）是一種高度多態性的基因，是人體內主要的藥物轉運蛋白P-糖蛋白的編碼基因。包括順鉑在內的親脂性抗腫瘤藥可以誘導MDR1 的表達。 色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）是一種內源性糖蛋白，具有促進腫瘤細胞凋亡、分化、抑制增殖和血管生成的作用。肺耐藥蛋白（lung resistance-related protein,LRP）是與MDR1 呈正相關的藥物外排轉運蛋白，在藥物抵抗中有重要作用[4]。本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及免疫組織化學法檢測MDR1、PEDF 和LRP 在宮頸癌組織和正常宮頸組織的表達，探討其表達水平與宮頸癌臨床特征和預后的關系，為宮頸癌的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月—2015年12月在安徽醫科大學附屬安慶醫院就診的宮頸癌患者58 例（宮頸癌組）及子宮良性病變行子宮切除術患者9 例（對照組）。宮頸癌組年齡24～73歲，平均（63.46±4.73）歲；平均體重指數為（22.39±3.06）kg/m2；病理類型均為鱗癌；FIGO 分期標準：Ⅰ期20 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期16例。對照組年齡22～66歲，平均（53.46±4.33）歲；平均體重指數為（21.79±3.24）kg/m2。納入標準：經病理證實為宮頸鱗狀細胞癌；未經化療、放療及免疫治療；取得患者知情同意并經醫院倫理委員會批準。排除標準：既往有宮頸病變史及免疫缺陷者。

1.2 RT-PCR 檢測MDR1、PEDF、LRP mRNA 相對表達量

取宮頸癌組患者癌組織和對照組的正常宮頸組織檢測MDR1、PEDF、LRP mRNA 相對表達量。采集組織標本后立即將其置于含營養液的無菌瓶中，送實驗室處理。用Hank's 液（上海信裕生物科技有限公司）清洗上述組織標本，腫瘤組織標本需切除壞死組織及周圍正常組織，剪碎至約1 mm×1 mm小塊，加膠原酶37℃消化，制成單細胞懸液。隨后Trizol 法提取組織總RNA，逆轉錄成cDNA。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環40 次。MDR1、PEDF、LRP 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列見表1。內參基因選擇GAPDH。以cDNA 為模板用上述引物進行RT-PCR，PCR 相關試劑購自于寶生物工程（大連）有限公司。自動生成循環閾值（Ct），2-ΔΔCt法計算MDR1、PEDF、LRP mRNA 相對表達量。RT-PCR結果判定在內參擴增條帶一致的基礎上，在目的條帶位置出現條帶者為陽性表達，未出現條帶者為陰性表達。根據條帶亮度測量光密度值，目的條帶光密度值/內參光密度值得到相對系數。

表1 引物序列

1.3 免疫組織化學法檢測MDR1、PEDF和LRP蛋白陽性表達

MDR1 兔單克隆抗體（ab170904）、PEDF 兔多克隆抗體（ab233120）和LRP 兔單克隆抗體（ab175239）購自艾博抗（上海）貿易有限公司，免疫組織化學染色試劑盒及DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。采用Envision 兩步法檢測MDR1、PEDF 和LRP 蛋白的陽性表達。選取宮頸癌組織石蠟標本切片，厚度為4 μm，烤片后脫蠟和過梯度酒精水洗，進行抗原修復，并用3% H2O2室溫孵育20 min 以阻斷內源性過氧化物，PBS 清洗后滴加一抗4℃孵育過夜，同時設置陰性對照及陽性對照。第2 天洗去一抗并滴加二抗孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染細胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明后立即中性樹膠封片。免疫組織化學染色由兩位病理科醫生在400 倍鏡下獨立進行統計，以棕黃色染色為陽性。著色強度評分：未著色0 分，淡黃色1 分，黃色2 分，黃棕色或黃褐色3 分。陽性細胞百分比評分：染色細胞占視野細胞的1%～25%為1 分，>25%～50%為2 分，>50%～75%為3 分，>75%為4 分。最終評分=陽性細胞百分比得分+著色強度評分，<6 分為弱陽性即低表達，≥6 分為強陽性即高表達。

1.4 統計學方法

數據處理采用SPSS 21.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗；繪制ROC曲線。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MDR1、PEDF和LRP mRNA相對表達量比較

兩組MDR1、PEDF 和LRP mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05），宮頸癌組MDR1、LRP mRNA 相對表達量高于對照組，PEDF mRNA相對表達量低于對照組。見表1。

表1 兩組MDR1、PEDF和LRP mRNA相對表達量比較（±s）

表1 兩組MDR1、PEDF和LRP mRNA相對表達量比較（±s）

組別n MDR1 mRNA PEDF mRNA LRP mRNA宮頸癌組對照組t 值P 值58 9 0.87±0.14 0.39±0.10 9.872 0.000 0.23±0.07 0.79±0.11 20.549 0.000 0.75±0.12 0.22±0.13 12.198 0.000

2.2 兩組MDR1、PEDF 和LRP 蛋白陽性表達率比較

兩組MDR1、PEDF 和LRP 蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05），宮頸癌組MDR1和LRP 的蛋白陽性表達率高于對照組，PEDF 的蛋白陽性表達率低于對照組。見表2。

表2 兩組MDR1、PEDF和LRP蛋白陽性表達率的比較

2.3 宮頸癌組不同臨床病理特征患者的MDR1、PEDF和LRP蛋白陽性表達率比較

58 例宮頸癌組患者中，不同FIGO 分期和有無淋巴結轉移患者的MDR1、PEDF 及LRP 蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05）；不同年齡的MDR1、PEDF 及LRP 蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 宮頸癌組不同臨床病理特征患者MDR1、PEDF和LRP蛋白陽性表達率的比較 例（%）

2.4 MDR1、PEDF 和LRP 高表達和低表達患者中位生存期和5年生存率比較

宮頸癌組患者均門診或電話隨訪，其中4 例患者失訪，共54 例患者完成隨訪。根據MDR1、PEDF和LRP 蛋白表達的高低，分為MDR1、PEDF、LRP 高表達組和低表達組。MDR1 高表達組中位生存期為46 個月，MDR1 低表達組中位生存期為51 個月；MDR1 高表達組和低表達組5年生存率分別為31.5%（17/54）和61.1%（33/54），兩組5年生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.781，P=0.001），MDR1 高表達組5年生存率低于MDR1 低表達組（見圖1）。PEDF 高表達組中位生存期為53 個月，PEDF 低表達組中位生存期為46 個月；PEDF 高表達組和低表達組5年生存率分別為79.6%（43/54）和40.7%（22/54），兩組5年生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.354，P=0.000），PEDF 低表達組5年生存率低于PEDF 高表達組（見圖2）。LRP 高表達組中位生存期為50 個月，LRP 低表達組中位生存期為52 個月；LRP 高表達組和低表達組5年生存率分別為40.7%（22/54）和75.9%（41/54），兩組5年生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.154，P=0.002），LRP 高表達組5年生存率低于LRP 低表達組（見圖3）。

圖1 宮頸癌組MDR1高表達和低表達患者的生存曲線

圖2 宮頸癌組PEDF高表達和低表達患者的生存曲線

圖3 宮頸癌組LRP高表達和低表達患者的生存曲線

2.5 MDR1、PEDF和LRP表達對宮頸癌的診斷價值

MDR1 蛋白表達診斷的ROC 曲線下面積為0.884（95% CI：0.819，0.950），敏感性為78.3%（95%CI：0.702，0.864），特異性為81.2%（95% CI：0.753，0.871），具有一定的診斷價值（見圖4）。PEDF 蛋白表達診斷的ROC 曲線下面積為0.734（95% CI：0.696，0.773），敏感性為71.3%（95% CI：0.667，0.759），特異性為74.2%（95% CI：0.698，0.786），具有一定的診斷價值（見圖5）。LRP 蛋白表達診斷的ROC 曲線下面積為0.716（95% CI：0.684，0.749），敏感性為70.4%（95% CI：0.654，0.754），特異性為71.5%（95% CI：0.653，0.777），具有一定的診斷價值（見圖6）。

圖4 MDR1表達對宮頸癌診斷價值的ROC曲線

圖5 PEDF表達對宮頸癌診斷價值的ROC曲線

圖6 LRP表達對宮頸癌診斷價值的ROC曲線

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居女性腫瘤第4 位[5]。宮頸癌早期主要通過子宮根治術治療，放化療是局部晚期的宮頸癌患者的標準治療方法，然而部分宮頸癌患者對化療有耐藥性，預后差[6-8]。化療耐藥被廣泛認為是限制治療效果和影響患者預后的因素之一[9]。美國癌癥協會統計，每年死于癌癥的患者中，33%與獲得性耐藥有關[10]。因此，逆轉或抑制腫瘤治療過程中的多藥耐藥效應具有重要意義。然而對宮頸癌耐藥的機制尚未完全清楚，闡明宮頸癌耐藥的機制是宮頸癌治療亟待解決的問題。

研究表明，MDR1 在多個耐藥細胞系和宮頸癌細胞中過表達[11]。MDR1 在HeLa 細胞中的表達升高，導致細胞內藥物排泄增加，細胞內藥物濃度降低，導致HeLa 細胞產生耐藥性。在胰腺癌中也有報道，MDR 蛋白表達增加與化療耐藥有關[12]。其變異與蛋白功能、抗癌藥動力學改變及患者預后相關[13]。NF-κB、c-fos 和c-jun 已被證明與MDR1 基因的轉錄激活有關[11]。有研究表明，MDR1 通過與其他蛋白的相互作用，參與調控細胞的侵襲和遷移，從而激活ERK1/2 和P38 MAPK 信號通路，誘導基質金屬蛋白酶等腫瘤細胞侵襲相關蛋白的產生[14]。本研究結果顯示，宮頸癌組織中MDR1 蛋白陽性表達率高于正常宮頸組織，且與FIGO 分期有關，其中FIGOⅢ期蛋白陽性表達率最高，其次為FIGOⅡ期，FIGOⅠ期最低。MDR1 蛋白陽性表達率也與淋巴結轉移有關，在有淋巴結轉移的宮頸癌組織中蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移的宮頸癌組織。MDR1 蛋白陽性表達率與年齡無關。MDR1 高表達宮頸癌患者5年生存率低于MDR1 低表達宮頸癌患者。

PEDF 作為一個抑癌基因常在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌中被報道，但在宮頸癌中很少被研究[15]。PEDF 作為一種有前景的治療靶點，已經在黑色素瘤、肝細胞癌、結腸癌等多種腫瘤中取得較好的治療效果[16-18]。葉酸受體α（FRα）靶向的納米脂質體作為載體包裹PEDF基因，經腹腔注射治療宮頸癌腹膜轉移也取得了令人滿意的抗腫瘤效果[15]。本研究結果顯示，宮頸癌組織中PEDF 蛋白陽性表達率低于正常宮頸組織，且與FIGO 分期有關，其中FIGOⅠ期蛋白陽性表達率最高，其次為FIGOⅡ期，FIGOⅢ期最低。PEDF 蛋白陽性表達率也與淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移的宮頸癌組織中蛋白陽性表達率低于無淋巴結轉移的宮頸癌組織。PEDF 蛋白陽性表達率與年齡無關。PEDF 高表達宮頸癌患者5年生存率高于PEDF低表達宮頸癌患者。

LRP 在核質轉運、細胞凋亡、DNA 損傷修復、細胞解毒和化療耐藥方面發揮重要作用[19]。LRP 在多發性骨髓瘤、急性白血病等腫瘤中的異常表達可能導致治療效果較差[20]。Akt/ERK-FOXO1-Nanog 信號通路可調節LRP 蛋白表達，促進凋亡，提高宮頸癌細胞對順鉑的敏感性[20]。腫瘤壞死因子相關的誘導凋亡配體可以通過減少MDR1 和LRP 的表達，誘導細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖從而逆轉胃癌細胞的耐藥性[21]。本研究結果顯示，宮頸癌組織中LRP 蛋白陽性表達率高于正常宮頸組織，且與FIGO 分期有關，其中FIGOⅢ期蛋白陽性表達率最高，其次為FIGOⅡ期，FIGOⅠ期最低。LRP 蛋白陽性表達率也與淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移的宮頸癌組織中蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移的宮頸癌組織。LRP 蛋白陽性表達率與年齡無關。LRP 高表達宮頸癌患者5年生存率低于LRP 低表達宮頸癌患者。

綜上所述，MDR1、PEDF 和LRP 的表達與宮頸癌的發生、發展密切相關，可作為宮頸癌患者臨床特征與預后的參考指標。研究MDR1、PEDF 和LRP 對宮頸癌的診斷和治療具有重要的指導意義。