利用小RNA深度測序快速鑒定草莓病毒

何成勇 高德航 范靈姣 邢 飛 李世訪 王紅清*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，北京 100193； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是一種重要的經(jīng)濟作物，在世界各地被廣泛種植。由于草莓成熟早和見效快，近幾年我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。然而，由于草莓的多年生長和長期的無性繁殖，導(dǎo)致其生長過程中易受到多種病毒的侵染[1]，造成果實品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低[2]。目前，已有20多種病毒[3-6]和1種類病毒[7]被報道能夠侵染草莓，當前我國各草莓產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的草莓病毒有：草莓斑駁病毒(strawberry mottle virus，SMoV)、草莓鑲脈病毒(strawberry vein banding virus，SVBV)、草莓皺縮病毒(strawberry crinkle virus，SCV)和草莓輕型黃邊病毒(strawberry mild yellow edge virus，SMYEV)；其他病毒如黃瓜花葉病毒[8](cucumber mosaic virus, CMV)、草莓壞死休克病毒[9](strawberry necrotic shock virus, SNSV)、草莓白化病毒[10](strawberry pallidosis associated virus，SPaV)、草莓毛形病毒3(strawberry crinivirus 3,SCrV 3)和草莓毛形病毒4[11](strawberry crinivirus 4,SCrV 4)等在我國部分草莓產(chǎn)區(qū)也有報道。草莓病毒大多屬于潛隱性病毒，單一侵染時一般不顯病癥，復(fù)合侵染時造成花葉、皺葉、葉柄病變、葉脈褪綠、果實畸形、品質(zhì)變劣、產(chǎn)量下降和植株矮小等癥狀，而且一旦植株感染病毒將終生帶毒且無法脫除。草莓病毒病嚴重制約著我國乃至世界草莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，快速解析草莓植株中的病毒對于草莓病毒病的防控意義重大。

草莓病毒的傳統(tǒng)檢測方法有指示植物檢測法[12]、電鏡檢測法[13]、血清學(xué)檢測法[14]和分子生物學(xué)檢測法等，但傳統(tǒng)的病毒檢測方法有其局限性，如指示植物檢測法對嫁接技術(shù)要求較高，耗時較長，且由于病毒的混合侵染和不同組織病毒含量的差異造成該鑒定方法實際操作難度較大[15]；電鏡檢測法價格昂貴而且對初學(xué)者來說掌握的難度比較大，檢測結(jié)果往往容易受到破碎的植物細胞器的干擾[16]；血清學(xué)檢測法需要根據(jù)每種病毒制備特異抗體，過程復(fù)雜；較為常用的PCR檢測方法需要根據(jù)已知病毒序列設(shè)計PCR引物，在病毒序列變異度高或檢測未知病毒時則很難發(fā)揮作用。近年來，sRNA測序技術(shù)的發(fā)展為植物病毒檢測提供了新的思路。sRNA測序的原理是對寄主體內(nèi)病毒來源的小RNA(virus-derived small interfering RNA, vsiRNA)進行測序和分析，從而鑒定寄主中的病毒種類。sRNA測序因其可同時檢測DNA和RNA病毒且不受病毒poly(A)結(jié)構(gòu)的影響等優(yōu)點已被廣泛用于葡萄[17]、西番蓮[18]、庫爾勒香梨[19]和柑橘[20]等果樹病毒的檢測中。目前，國內(nèi)應(yīng)用sRNA測序鑒定草莓病毒的報道較少。本研究通過sRNA測序技術(shù)鑒定了‘豐香’和‘哈尼’2個草莓品種中存在的病毒，并通過RT-PCR對測序結(jié)果進行了驗證，旨在為草莓病毒的快速鑒定及明確草莓病毒的種類和分布提供研究方法和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘豐香’草莓和‘哈尼’草莓為試驗材料。每個草莓品種各隨機采集2份樣品，分別于2020年7—8月, 采自山東青島(‘豐香’草莓)和遼寧東港(‘哈尼’草莓)，采集幼嫩的草莓新葉，液氮速凍后于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA提取與檢測

草莓葉片總RNA的提取采用改良的CTAB法[21]，利用Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，Wilmington，USA)檢測總RNA的濃度與純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.2sRNA文庫構(gòu)建及測序

sRNA測序文庫構(gòu)建及測序由聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。sRNA測序文庫制備采用TruSeqTMSmall RNA Sample Prep Kits (Illumina, San Diego, USA)試劑盒。將4份樣品分別提取的總RNA等量混合后，首先利用T4 RNA連接酶(Truncated)將一個腺苷化單鏈DNA3′接頭和5′接頭相繼連接到sRNA上，通過與3′端互補的RT引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后進行PCR擴增得到cDNA序列。用6% polyacrylamide Tris-borate -EDTA膠回收長度大約在140 bp的PCR產(chǎn)物，從而完成整個文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina Hiseq 2500進行測序，測序讀取長度為單端1×50 bp。

1.2.3病毒sRNA序列分析

測序獲得的原始數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量序列后將5′和3′接頭序列信息去除，獲得clean reads；保留長度在18～25 nt的核苷酸序列，并比對mRNA、RFam和Repbase數(shù)據(jù)庫。隨后將序列與宿主基因組比對，過濾比對到基因組的序列。將不能定位到宿主基因組的序列與病毒數(shù)據(jù)庫進行比對并進行熱點區(qū)分布分析。然后用Velvet軟件進行序列拼接，獲得較長的contigs。最后，拼接完成后用NT和NR數(shù)據(jù)庫進行病毒注釋。

1.2.4RT-PCR驗證測序結(jié)果

以草莓總RNA為模板合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系為：RNA 1 μg、5×M-MLV buffer (Promega)2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)、隨機引物(6 mer)和Oligo-dT各1 μL，M-MLV和RNase Inhibitor 各0.5 μL，RNase free water補足體系至10 μL，混勻，42 ℃反應(yīng)60 min，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)比對得到的病毒核苷酸序列[22-24]，設(shè)計特異引物(表1)，用于RT-PCR檢測，引物由北京六合華大科技有限公司合成。PCR擴增體系為：cDNA 2 μL、2×pfu PCR Mastermix(天根生化科技有限公司)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補足體積至20 μL，充分混勻。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pTOPO載體(艾德萊)上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆測序驗證。

表1 用于檢測5種草莓病毒的引物序列Table 1 Primers used for five strawberry viruses detection

2 結(jié)果與分析

2.1 sRNA測序結(jié)果與分析

對‘豐香’和‘哈尼’2個草莓品種混樣后進行sRNA測序，對sRNA測序數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果在混合樣品中獲得的sRNA總數(shù)為15 403 693，去除低質(zhì)量序列，保留去除接頭序列后長度在18～25 nt 的序列，篩選獲得的clean reads數(shù)為11 685 131，占sRNA總數(shù)的75.86%。研究表明感染病毒的植物體內(nèi)富集的病毒sRNA主要分為3個類型：21、22和24 nt，本研究從感染病毒的草莓樣品中富集到的sRNA長度主要為21、24和22 nt(圖1)，reads數(shù)分別為4 080 830，3 585 518和1 996 530。獲得的clean reads數(shù)的占比與sRNA的長度分布均表明從樣本中獲得的sRNA質(zhì)量可靠。

圖1 sRNA長度分布統(tǒng)計Fig.1 Statistics of sRNA length distribution

2.2 sRNA序列的拼接與注釋

應(yīng)用Velvet軟件對sRNA進行序列拼接，獲得較長的contigs。拼接后的序列用NT數(shù)據(jù)庫進行病毒注釋(表2)。結(jié)果顯示共有242個contigs比對到5種草莓病毒，其中98個contigs比對到草莓白化病毒(SPaV)，長度在34～191 nt，相似性為77%～100%，在基因組上的覆蓋度為31%；61個contigs比對到草莓鑲脈病毒(SVBV)，長度在34～116 nt，相似性為88%～100%，在基因組上的覆蓋度為50%；51個contigs比對到草莓斑駁病毒(SMoV)，長度在34～123 nt，相似性為82%～100%，在基因組上的覆蓋度為23%；16個contigs比對到草莓毛形病毒3(SCrV 3)，長度在51～131 nt，相似性為92%～100%；16個contigs比對到草莓毛形病毒4(SCrV 4)，長度在41～154 nt，相似性為77%～94%。綜合比對到草莓病毒的contigs數(shù)、覆蓋度和相似性，推測混合樣本中含有這5種病毒的可能性大小依次為：SVBV、SPaV、SMoV、SCrV 3和SCrV 4。

表2 sRNA測序檢出草莓病毒數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of detected strawberry viruses by sRNA sequencing

2.3 RT-PCR驗證

為驗證sRNA測序結(jié)果的可靠性，根據(jù)比對到的草莓病毒序列設(shè)計5種病毒的特異引物(表1)，分別對4份樣品進行RT-PCR擴增。結(jié)果顯示，部分樣品中分別擴增得到大小為462、278、517、517和549 bp的特異性條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)與GenBank中登錄序列比對后發(fā)現(xiàn)，SMoV、SVBV和SCrV 3在4份樣品中均檢測到，而SPaV和SCrV 4只在2份‘哈尼’草莓樣品中檢測到。RT-PCR結(jié)果表明，本研究中經(jīng)sRNA測序比對到的草莓病毒均存在于草莓樣本中。RT-PCR與sRNA測序結(jié)果一致，說明利用sRNA測序鑒定草莓病毒的結(jié)果可靠。

M，DNA標準DL2 000；PC，陽性對照； CK，健康植株；1～2，‘豐香’草莓；3～4，‘哈尼’草莓。M， DL2 000 DNA Marker； PC， Positive control； CK， healthy plant；1-2， ‘Toyonoka’； 3-4， ‘Honeoye’.圖2 5種草莓病毒的RT-PCR擴增Fig.2 RT-PCR amplification results of five kinds of strawberry viruses

3 討論與結(jié)論

RNA沉默(RNA silencing)是植物抗病毒的主要機制，植物體內(nèi)的DCL蛋白可將病毒來源的雙鏈RNA(dsRNA)或中間復(fù)合體加工形成大量長度在21～24 nt病毒來源的小干擾RNA(vsiRNA)[25-26]。sRNA深度測序技術(shù)檢測病毒是基于RNA沉默原理的一種病毒檢測技術(shù)，對感染病毒的植株進行sRNA深度測序，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，獲得的序列信息中包含與病毒序列高度一致的siRNA序列，再通過重新組裝獲得相關(guān)的目標病毒基因組的信息，可為發(fā)現(xiàn)新的病毒和鑒定病毒提供較充足的證據(jù)。本研究利用sRNA深度測序技術(shù)，從2份‘豐香’草莓和2份‘哈尼’草莓的混合樣品中檢測到SMoV、SVBV、SPaV、SCrV 3和SCrV 4共5種草莓病毒，后續(xù)利用RT-PCR驗證測序結(jié)果時在2份‘豐香’草莓樣品種檢測到SMoV、SVBV和SCrV 3等3種病毒，而在2份‘哈尼’草莓樣品中同時檢測到這5種病毒，這與sRNA測序結(jié)果一致，證實了該方法鑒定草莓病毒的準確性和可靠性。

本研究檢測出的5種病毒中，SMoV和SVBV是國內(nèi)較為常見的草莓病毒，另外3種病毒在國內(nèi)報道較少。Ding等[27]2017年首次在我國福建報道了SPaV能夠侵染草莓;韓曉玉等[28]在河南鄭州和新鄉(xiāng)的草莓上也檢測到SPaV;本研究中檢測到SPaV的草莓品種‘哈尼’采自遼寧東港，說明該病毒分布的地理跨度較大。目前國內(nèi)僅在這3個省市的草莓上檢測到該病毒，至于其他草莓產(chǎn)區(qū)是否存在SPaV，將是今后草莓病毒檢測需要關(guān)注的地方。SCrV 3和SCrV 4同屬毛形病毒屬，Chen等[11]2018年在福建福州地區(qū)首次報道了SCrV 3和SCrV 4，但在后續(xù)的調(diào)查中并沒有檢測到這2種病毒，說明這2種病毒的分布并不廣泛。本研究中，SCrV 4僅在‘哈尼’草莓樣品中檢測到，而SCrV 3在‘哈尼’草莓和采自山東青島的‘豐香’草莓品種中均檢測到。本研究是第2次報道這2種病毒在國內(nèi)其他草莓產(chǎn)區(qū)的存在，因此，其發(fā)生和分布值得進一步關(guān)注。

草莓病毒的復(fù)合侵染是造成草莓衰退病的主要誘因，嚴重降低草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量。謝雪花[29]利用sRNA測序在長沙地區(qū)的草莓上同時檢測到CMV和SVBV；李偉佳等[9]利用RNA-Seq在同一草莓植株上同時檢測到2～3種病毒；本研究在同一植株上最少檢測到3種病毒，最多檢測到5種病毒，說明草莓病毒的復(fù)合侵染較為普遍。需要注意的是，本研究中被病毒復(fù)合侵染的草莓植株并未表現(xiàn)出明顯的病毒病癥狀，這對于草莓病毒病的發(fā)現(xiàn)和預(yù)防帶來一定難度。至于復(fù)合侵染是否對草莓產(chǎn)量有影響將是下一步研究的重點。

本研究利用sRNA測序技術(shù)從2個草莓品種中共檢測到5種病毒，并利用RT-PCR技術(shù)進行了驗證，首次在我國生產(chǎn)的同一個草莓品種中檢測到5種病毒。本研究可為草莓病毒的鑒定和監(jiān)測工作提供借鑒。