氮素和紅藍復合光配比對莧菜幼苗亞硝酸還原酶活性及其基因表達的影響

陳 何 王 樂 趙春麗 肖 昉 鄭友峰 劉生財

(福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

莧菜(AmaranthustricolorL.)是石竹目莧科莧屬下的一年生草本植物，莖葉茂盛，在我國南北各地均有栽培，是夏季的主要蔬菜之一，莧菜不論莖葉還是種子均具有營養價值和藥用價值[1]。為了保證莧菜周年生產，可以利用光源植物工廠進行生產。而營養元素和光照是植物工廠最重要的2個調控因素[2]。氮素是植物生長發育所必須的基本營養元素之一，在植物生長發育中發揮著重要作用，直接影響蔬菜的產量和品質。硝態氮(NO3-)和銨態氮(NH4+)是植物吸收和利用的2種主要的無機氮素形態，影響植物的氮素同化過程，調控植物生長[3-4]。亞硝酸還原酶(nitrite reductase，NiR)是氮素同化途徑的關鍵控制酶[5]。與硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)相比較,有關NiR的研究較少。Lahners等[6]首先提出了玉米NiR分子結構。隨后在菠菜、水稻、煙草、擬南芥、白菜和小麥等高等植物中均克隆出NiR基因[7-11]。此外，光質對植物氮代謝關鍵酶表達調控也有著十分重要的作用，在對水稻、番茄、黃瓜和煙草等作物的研究中發現[12-15]，藍光處理可提高植株NiR基因的相對表達量，有效改善氮代謝，進而促進其總氮升高；而紅光有利于提高植株碳水化合物含量，能夠促進植株莖粗和干鮮重[13]。近年來的研究發現紅藍組合光能夠顯著提高植物氮代謝相關酶活性和植株體內游離氨基酸含量[16]；增加紅藍復合光中藍光比例可增強苦瓜幼苗和桑樹幼苗葉片氮代謝[17-18]。

但是目前對于不同紅藍復合光配比對氮代謝的影響更多集中于硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)及谷氨酸合成酶(glutamate synthase，GOGAT)這3種酶活性而對NiR酶活性的研究很少，在轉錄水平上研究也多集中于NR和NiR基因，本研究則從NR、NiR、NRT和AMT4個基因來分析不同配比紅藍復合光對莧菜氮代謝的影響。以莧菜幼苗為材料，克隆了氮代謝關鍵基因AtrNiR基因，測定了不同氮素形態配比處理后NiR酶的活性，以及轉錄水平下AtrNiR基因的表達變化，以此來確定最佳氮素形態配比；在最佳氮配比條件下，再進行紅藍復合光配比篩選，為最適宜莧菜植物工廠的光環境參數[19]設計提供依據，為將來進一步研究莧菜AtrNiR基因功能奠定基礎，同時改善因過量施肥所導致的硝酸鹽和亞硝酸鹽積累的污染[20]。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以‘大紅’莧菜為材料，試驗材料由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1材料處理

將‘大紅’莧菜種子均勻地播種于鋪有2層濾紙的塑料培養皿上(每個培養皿約80粒)，然后將培養皿隨機分為6組，每組3盤，每個培養皿加入5 mL的蒸餾水，放入光照培養室(25 ℃，白光，光照時間12 h/d)培養7 d，期間每個培養皿補充200 μL的蒸餾水，保證濾紙的濕潤。

然后向5個處理N1～N5(表1)的每個培養皿中加入5 mL N溶液，以添加蒸餾水為對照(CK)。之后將材料繼續放入光照培養室培養，將每3個培養皿材料作為一次重復用于取樣，分別在培養3和6 d時，取樣品的胚軸和子葉，用液氮凍存并保存于-80 ℃冰箱用于NiR酶活性測定、莧菜總RNA提取及qRT-PCR分析。為后續試驗確實最佳氮配比。每種處理設置3次重復。

表1 不同處理下N溶液的銨硝摩爾配比Table 1 Ammonium and nitrate molar ratio of N solution under different treatment

同樣，按照上述方法獲得7 d莧菜幼苗后，向每組培養皿加入5 mL N3(最佳氮配比)溶液，隨即將材料分別放入不同紅藍復合光下培養，培養條件設置R∶B(即Red∶Blue)=0∶10(116 μmol/(m2·s))、R∶B=2∶8(108 μmol/(m2·s))、R∶B=4∶6(148 μmol/(m2·s))、R∶B=6∶4(159 μmol/(m2·s))、R∶B=8∶2(171 μmol/(m2·s))、R∶B=10∶0(201 μmol/(m2·s))下培養，光照時間12 h/d。將每3個培養皿材料作為1次重復，在培養3 d取樣品的胚軸和子葉，用液氮凍存并保存于-80 ℃冰箱用于NiR酶活性測定及qRT-PCR分析。每種處理設置3次重復。

1.2.2莧菜總RNA提取及cDNA合成

利用購買于北京百泰克生物技術有限公司的多糖多酚RNA提取試劑盒，提取莧菜材料總RNA,提取后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，之后利用實驗室的超微量分光光度計(Thermo Electron Corp，USA)檢測提取出的莧菜RNA樣品濃度,再利用Gene RacerTM試劑盒(TaKaRa)將提取出的莧菜材料總RNA反轉錄為cDNA，用反轉錄出的cDNA進行NiR基因克隆。

1.2.3莧菜AtrNiR基因的克隆

根據莧菜轉錄組數據庫(SRA:SSR924089-SSR924092)，查找數據庫中NiR基因序列片段，查找出后將其與NBCI中登錄的NiR基因進行序列比對，找出具有完整ORF序列片段，利用DNAMAN軟件設計莧菜NiR基因的ORF克隆引物(表2)。參照TaKaRa LA Taq說明書進行PCR擴增，擴增后首先用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物長度及完整性，隨即將長度正確且完整的目的片段切膠回收，之后通過TA克隆，挑取生成的陽性克隆進行搖菌，菌液渾濁后進行菌液PCR擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后將菌液中有目的條帶的樣品送到北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.4生物信息學分析

使用ExPASy-Prot-param(https:∥web.expasy.org/protparam)、Plant-mPLoc (https:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi)、NCBI-CDS(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、ExPASy-PROSITE數據庫(https:∥prosite.expasy.org)、NetPhos 3.1(https:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)、PSIPRED(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)及SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)等在線軟件預測編碼蛋白的理化性質亞細胞定位、蛋白結構域、蛋白功能位點、蛋白質磷酸化位點、蛋白二級結構以及蛋白三級結構。使用DNAMAN軟件進行莧菜NiR引物設計、序列拼接及比對，使用MEGA-X軟件Neighbor-Joining法參數都設為默認值，構建NiR蛋白系統進化樹。

1.2.5NiR酶活性測定

按照蘇州科銘生物技術有限公司的NiR酶試劑盒說明書，測定上述莧菜材料中酶的活性并進行計算。

1.2.6qRT-PCR分析

在克隆出莧菜AtrNiR基因ORF基礎上設計相對定量表達特異引物，并根據莧菜轉錄組數據庫(SRA:SSR924089-SSR924092)設計植物氮代謝途徑中的關鍵基因AtrNR(nitrate reductase)、AtrAMT(ammonium transporter)和AtrNRT(nitrogen transporter)相對定量表達特異引物(表2)。通過qRT-PCR檢測不同處理下AtrNiR、AtrNR、AtrNRT和ArtAMT基因在上述材料中的表達情況。參照SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(TaKaRa)，qRT-PCR反應體系為20 μL，每個樣品設置3次生物學重復，利用羅氏LightCycler 480儀器分別擴增4個基因及內標基因EF1a，利用2-ΔΔCt法分別計算4個基因的相對表達量。

1.2.7數據分析

使用Excel 2010統計數據，使用SPSS 22.0分析數據差異顯著性，使用Origin 2017繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 莧菜AtrNiR cDNA序列的克隆

以上述莧菜材料提取出的cDNA作為模板，通過莧菜轉錄組數據庫信息篩選莧菜NiR基因cDNA片段來設計引物，進行PCR擴增驗證ORF(圖1)。最終獲得莧菜NiR基因的ORF序列，命名為AtrNiR(GenBank登錄號：MT374155)。莧菜AtrNiR基因ORF全長為1 785 bp，編碼594個氨基酸。

M，DNA標準DL.5 000；1～4，AtrNiR基因的擴增產物。M, DL.5 000 DNA Marker; 1-4, products of AtrNiR gene.圖1 莧菜AtrNiR基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of AtrNiR gene

2.2 莧菜AtrNiR基因生物信息學分析

使用在線軟件ProtParam預測莧菜AtrNiR基因編碼蛋白質理化性質，發現AtrNiR蛋白分子式為C2937H4692N828O873S28，相對分子質量為66.47 ku，理論等電點為6.00，總原子數為9 358，總平均疏水指數為-0.316，可以得知AtrNiR是親水性蛋白。使用NCBI-CDS及PROSITE預測蛋白結構域及功能位點，發現該蛋白含有1個保守結構域，即PLN02431 superfamily(圖2)，也就是ferredoxin-nitrite reductase，功能位點位于序列的中后位置。使用PSORT預測亞細胞定位，發現該蛋白65.2%可能性位于線粒體(mitochondrial)，21.7%可能性位于細胞核(nuclear)以及13.0%可能性位于細胞質(cytoplasmic)。使用在線軟件PSIPRED預測AtrNiR蛋白二級結構，發現該蛋白二級結構是以無規則卷曲和α-螺旋為主，分別占43.03%和36.81%。利用SWISS-MODEL預測蛋白三級結構，發現該模型是以菠菜NiR作為結構基礎建模，兩者序列一致性達91.68%(圖3)。通過MEGA-X將莧菜AtrNiR蛋白與NCBI中登錄的20種植物的NiR蛋白作進化樹分析發現，20種NiR蛋白分為5個分支，莧菜AtrNiR與擬南芥、菠菜、甜菜及藜麥的NiR 蛋白聚為1個分支(圖4)。

圖2 莧菜AtrNiR蛋白氨基酸序列保守結構域檢索Fig.2 Conservative domain search of amino acid sequence of AtrNiR

圖3 預測的莧菜AtrNiR三維結構Fig.3 Predicted three-dimensional structure of amaranth AtrNiR

分支上的數值表示1 000次重復抽樣符合聚類的百分數。The number on the branch represents the percentage of 1 000 repeated samples in accordance with the clustering.圖4 AtrNiR蛋白系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree for AtrNiR protein

2.3 不同處理對莧菜幼苗中NiR酶活性的影響

不同銨硝配比N溶液處理3 d后，莧菜幼苗NiR酶活性最高的是N5溶液處理，與對照組相比有顯著差異，最低的是N2溶液處理，與CK有極顯著差異，但是N2，N3和N4處理之間NiR酶活性沒有顯著差異(圖5(a))。不同銨硝配比N溶液處理6 d后，莧菜幼苗NiR酶活性最高的是N2溶液處理，除N1溶液處理，其它N溶液處理的莧菜幼苗NiR酶活性含量高與對照組相比顯示出極顯著差異，此時莧菜幼苗NiR酶活性含量隨著NH4+-N配比的增加呈現先上升后下降趨勢(圖5(b))。當相同銨硝配比(N3溶液)不同紅藍復合光配比下處理3 d，莧菜幼苗NiR酶活性含量最高的處理是R∶B=2∶8，以全藍光為對照，不同紅藍光配比處理下的莧菜幼苗NiR酶含量都與對照有著極顯著差異，但是除對照外，不同紅藍光配比處理間莧菜幼苗NiR酶活含量差異不明顯(圖5(c))，可能是因為處理3 d時間過短。

CK～N5表示不同銨硝摩爾配比(0∶0、0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0)。不同大寫字母表示0.01水平差異極顯著，不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。下同。CK-N5 represents different ammonium and nitrate molar ratio (0∶0, 0∶10, 3∶7, 5∶5, 7∶3, 10∶0). Different uppercase letters indicate extremely significant difference at 0.01 level, and different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same below.圖5 不同處理下莧菜幼苗中NiR酶活性Fig.5 Nitrite reductase activity of amaranth seedlings under different treatments

2.4 不同處理對AtrNiR、AtrNR、AtrNRT和AtrAMT基因在莧菜幼苗表達量的影響

當莧菜幼苗在不同銨硝配比的N溶液處理3 d后,AtrNiR和AtrNR表達量最大的都是N3溶液處理,表達量最低的都是N5溶液處理(圖6(a)和(b))，說明N3溶液處理對莧菜幼苗氮代謝有最大促進作用，以此確定了N3是后續研究不同紅藍光配比處理的最佳氮配比條件。經過不同銨硝配比N溶液處理后，AtrAMT基因表達量與CK相比均呈現極顯著下降(圖6(c))；而AtrNRT基因在N1處理下相對表達量最高，與CK相比有極顯著差異，隨著N溶液中NH4+-N配比的增加，AtrNRT基因表達量呈現先上升后下降的趨勢，其中N4和N5溶液處理下AtrNRT基因表達量的差異不顯著(圖6(d))。

圖6 不同銨硝配比處理3 d后AtrNiR(a)、AtrNR(b)、AtrAMT(c)和AtrNRT(d)基因的相對表達量Fig.6 Relative expression of AtrNiR (a), AtrNR (b), AtrAMT (c) and AtrNRT (d) genes in 3 days treated with different ammonium and nitrate ratio

向莧菜幼苗培養皿中加入N3溶液，以全藍光(R∶B=0∶10)為對照，莧菜幼苗經過不同紅藍光配比處理3 d后，4個基因在R∶B=0∶10和R∶B=2∶8 處理下的基因相對表達量均較高且與其它4個處理有極顯著差異。對AtrNiR和AtrNRT基因而言，R∶B=2∶8處理下基因相對表達量最高，與CK相比均有極顯著差異(圖7(a)和(d))；對AtrNR和AtrAMT基因而言，全藍光(R∶B=0∶10)處理下基因相對表達量最高，與其它處理相比有極顯著差異(圖7(b)和(c))。

圖7 不同紅藍光配比(R∶B)處理3 d后AtrNiR(a)、AtrNR(b)、AtrAMT(c)和AtrNRT(d)基因的相對表達量Fig.7 The relative expression of AtrNiR (a), AtrNR (b), AtrAMT (c) and AtrNRT (d) genes under different red and blue ratios treatment for 3 days

3 討論與結論

3.1 莧菜AtrNiR基因分析

本研究通過克隆首次在莧菜中獲得了NiR基因的ORF序列，命名為AtrNiR并在NCBI上提交，得到GenBank登錄號：MT374155。生物信息學分析及進化樹分析表明，莧菜AtrNiR編碼的蛋白屬于氮代謝相關蛋白，其氨基酸序列具有完整NiR結構，與其他物種NiR蛋白具有高度相似性。與莧菜AtrNiR蛋白親緣關系最近的是菠菜、甜菜和藜麥的NiR蛋白，并且和石竹目植物及擬南芥聚為一個分支[21]。以上結果表明莧菜AtrNiR屬于NiR家族，與其它植物中的NiR蛋白具有類似的功能，在生物進化過程中是保守的[22]。

3.2 不同氮素形態配比對莧菜NiR酶活性及AtrNiR基因相對表達量的影響

在高等植物葉片中，從 NO2-到NH4+的同化通過電子供體鐵氧還蛋白在葉綠體中由 NiR 完成[23]。在本研究中，不同氮素配比處理3 d后NiR酶活性在N5處理下最高，這與前人研究結果不一致，可能是處理時間不一致，NiR受到高濃度NH4+-N的短時誘導，活性提高；隨著處理時間增加，高濃度NH4+-N會抑制NiR活性，同時NO3--N 對NiR有促進作用[24]。當處理6 d時，NiR酶活性在N2處理下最高，說明不同氮素配比下的NiR酶活性比單一氮素下的更高，植物中NiR的基因表達規律會受到各種內在和外在因素的影響。對于不同氮素配比處理3 d后基因表達結果，AtrNiR與AtrNR都在N3處理下表達量最高，說明NR與NiR存在共促進和共抑制現象，二者是內在的偶聯關系[25]，AtrNR在N3處理下表達量最高且隨著NH4+-N配比的增加基因相對表達量呈現先上升后下降的趨勢，這與孫敏紅等[26]在枳橙幼苗中的研究結果一致。但是不同氮素形態配比下處理3 d莧菜NiR酶活性與AtrNiR基因變化趨勢不一致，可能是因為本研究只是克隆和定量分析了莧菜NiR基因家族其中1個成員，還有其他成員起到了協同或者相互抑制作用。有研究發現，參與茶氨酸合成途徑中相關基因家族不同成員在茶樹不同組織及發育時期也存在明顯表達差異[27]，因此對于莧菜NiR酶活性可能也是受整個NiR基因家族表達影響，而不是單一NiR基因影響，所以在本研究中AtrNiR基因表達變化趨勢與酶活性不一致，這還需要進一步研究。

3.3 不同紅藍光配比對莧菜NiR酶活性及AtrNiR基因相對表達量的影響

光是植物生長發育重要環境因子之一，植株體內合成氨基酸和蛋白質的主要途徑是植物氮代謝，增加紅藍復合光中藍光比例可促進植株的氮代謝[12,15]。NiR是氮同化過程中第二個關鍵酶，從本研究結果可以看出，不同紅藍復合光可顯著提高莧菜幼苗NiR酶活性且遠高于單一藍光和紅光處理，說明紅藍復合光能夠提升莧菜中將NO2-同化為NH4+的能力，這與王麗偉[28]在番茄幼苗中的結果相一致。在本研究中，在R∶B=0∶10與R∶B=2∶8處理下，AtrNiR、AtrAMT、AtrNR與AtrNRT的相對表達量都遠高于其他處理，可以說明氮代謝相關基因受藍光影響更大，增加復合光中藍光比例能夠提高莧菜氮代謝基因的轉錄水平，改善莧菜氮代謝，提升莧菜品質。在紅藍復合光處理下AtrNiR和AtrNRT相對表達量高于單一藍光，而AtrNR和AtrAMT剛好相反，變化趨勢不一致說明氮代謝相關基因轉錄水平的表達雖然受紅藍復合光調節，但是紅藍復合光對植株氮代謝部分基因轉錄水平的調節可能有著一個相對滯后的過程[28]。

有研究表明NiR對氮同化及NO生產這2個決定植物生長速率因素有著關鍵作用[29]，在獲得莧菜AtrNiR基因后，研究莧菜NiR基因結構，以及其在不同處理下的表達特性，可整體認識莧菜氮素初級同化，為后續更加全面分析NR、NiR、AMT及NRT等氮代謝關鍵基因間的相互作用奠定基礎。環境參數改變會導致植物代謝性狀顯著變化[30]，紅光和藍光處理能促進植物生長以及代謝物積累[31-32]。本研究結果表明，合適的銨硝配比和紅藍復合光配比可以顯著提高莧菜幼苗相關氮代謝酶活性和氮代謝基因相對表達量。通過后續進一步研究可以提高莧菜對氮的吸收利用效率，改善莧菜幼苗氮代謝，促進總氮升高，有助于后續更深入研究莧菜的氮代謝調節機制，同時為基因操作培育莧菜氮高效利用品種提供分子生物學理論依據[33]，對莧菜植物工廠環境參數設計及建立也具有重要的科學指導意義。