電針對缺血性腦卒中模型大鼠熱休克蛋白HSP60表達的影響

劉梅芳 楊光至 張霞輝 馮斯峰 徐連杰 周以皓 施靜

摘要：目的 觀察針灸對腦梗死大鼠HSP60、Caspase-3表達規律，初步探討針灸對缺血性腦卒中大鼠神經細胞凋亡保護的作用機制。方法 采用大腦中動脈線栓誘導腦缺血再灌注損傷模型，隨機假手術組、模型組、電針穴位組、電針非經非穴和艾灸穴位組。電針或艾灸干預后，術后0、12h評估大鼠的神經功能缺陷評分和姿勢反射評分;熒光定量PCR檢測HSP60和Caspase-3 mRNA的表達水平。結果 電針穴位組、艾灸穴位組大鼠神經功能均優于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，電針穴位組大鼠HSP60 mRNA顯著增加，差異有顯著性意義（P<0.05）;而Caspase-3 mRNA表達無明顯變化。結論 電針對大鼠腦缺血再灌注損傷神經功能有改善作用，其機制可能與上調腦組織中 HSP60表達，介導抗神經細胞凋亡有關。

關鍵詞：缺血性腦卒中;HSP60;Caspase-3;神經細胞凋亡

中圖分類號：R246 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）05-0069-04

【Abstract】Objective： To study the determination method of polysaccharides in Aconitum racemulosum and to establish a UV spectrophotometric method for the determination of polysaccharides from Aconitum Racemulosum， and to investigate the influence of different producing areas and different processing methods on the content of polysaccharides. Methods： The impurities such as reducing sugars were removed by 80% ethanol reflux and then the polysaccharides were extracted with hot water. The phenol-sulfuric acid colorimetry was used to measure absorbance value at 488 nm wavelength by ultraviolet-spectrophotometry to obtain the content of polysaccharides. . Results： The polysaccharide of Aconitum racemulosum was calculated as anhydrous glucose and showed a good linear relationship in the range of 0.003 to 0.015 mg/mL（R=0.9999）， and the recovery rate was 99.35%-99.85%（n=6）， and the RSD value was 0.18 %. Conclusion： This method is accurate， reliable， and reproducible， which is suitable for the determination of polysaccharide content in Aconitum racemulosum. There are certain differences in the polysaccharide content in different batches of medicinal materials from different origins. The processing method has no significant effect on the polysaccharide content of Aconitum racemulosum.

【Key words】Aconitum racemulosum; Polysaccharide; Ultraviolet Spectrophotometry; Producing Area; Processing

中風有著極高的發病率、患病率、死亡率、致殘率和復發率。世界范圍內，發病率平均為140～200/10萬[1]。缺血性腦中風仍是當今疾病中主要的致殘、致死原因，嚴重威脅人類的健康，并給家庭和社會帶來了很大的負擔，因此，探討其發病機制，尋找有效的治療方法一直是醫學工作者研究的熱點。缺血性腦損傷疾病發生與神經細胞凋亡密切相關，凋亡發生的重要原因之一是線粒體凋亡傳導通路的激活。線粒體通路激活后，繼而啟動Caspase-9激活，繼續激活Caspase-3，從而導致Caspase的級聯反應，最終促使細胞凋亡的發生[2-3]。HSP60作為熱休克蛋白家族中重要成員之一，在細胞凋亡過程中有其較強關聯性[4]。

電針療法是將針刺和電刺激相結合，通過脈沖電流作用于神經、肌肉引起神經興奮性傳導，消除神經纖維間水腫和神經滋養血管的痙攣，對腦卒中具有較好的臨床療效。本研究以線粒體通路引起凋亡為切入點，通過電針、艾灸刺激缺血性腦卒中大鼠，觀察其對腦卒中大鼠的干預效應，初步探討電針、艾灸對缺血性腦卒中大鼠神經細胞的保護機制，為臨床針灸治療腦缺血疾病的神經細胞保護提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 來源，種屬，品系：SD大鼠，7～8周齡，體重180～200 g，雌性，昆明動物研究所實驗動物中心提供，動物合格證號（SCXK（川）2015-030）;動物飼養在SPF級動物房，實驗動物至少飼養一周后使用。溫度22±2℃，濕度55±5%，12 h光暗循環。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。所有實驗均嚴格按照實驗動物有關條例進行。

1.2 主要試劑 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ購自大連Takara;Trizol裂解液購置天根生化（北京）科技有限公司;引物均由上海生物工程有限公司合成;艾條選用中國蘇州市東方艾絨廠。

1.3 主要儀器 Veriti PCR擴增儀購自美國ABI公司;MX3000P核酸擴增熒光檢測儀來自美國Aglient公司;Megafugel1.0R離心機購自德國Thermo Scientific Heraeus。6805-A電針儀購自廣東省汕頭市醫用設備廠。

1.4 模型誘導、分組及干預 采用孟宜良的線栓法制作大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血模型，并按照改良的Longa五點量表評分系統[5]對造模大鼠進行篩選。評分在 1～3 分為造模成功。以下2種情況為模型復制不成功，予以剔除：實驗過程中大鼠死亡;規定時間處死動物取腦時見有蛛網膜下腔出血或頸內動脈分叉部出血。動物模型成功后，隨機分為5組，每組5只，A組（假手術組）;B組（模型組）;C組（電針穴位組）;D組（電針非經非穴）;E組（艾灸穴位組）。待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩定，按照不同的分組分別施以不同治療，取穴和針刺手法參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》，選取“大椎”、“百會”、“人中”三穴進行針刺。針刺操作：“人中”向上刺lmm，“百會”向前斜刺2 mm，大椎直刺5 mm。針具選用佳健牌25號1寸一次性無菌針灸針;進針后捻轉1 min，平補平瀉，每次留針30 min。電針穴位組：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺大椎、百會、人中穴，接電針，留針30 min;電針非經非穴組：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺大椎、百會、人中穴的左側約0.3cm的非經非穴點處，接電針，留針30 min;艾灸穴位組：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，艾灸大椎、百會、人中穴，灸30 min。電針儀選用廣東省汕頭市醫用設備廠生產的6805-A 型，設定為疏密波，頻率2H以針柄微微顫動為度，刺激30 min。

1.5 神經功能缺陷評分 使用改良的Longa五點量表評分系統[5]分別對各組大鼠進行造模前、治療后12h神經功能缺陷評分和姿勢反射評分。神經功能缺陷評分標準：無神經缺陷為0分;左肢體不能完全伸展為1分;行走時向右側轉圈為2分;行走時向右側傾倒為3分;不能自發行走為4分;死亡為5分。姿勢反射評分標準：兩前肢完全伸展為0分（正常）;左前肢貼在胸部，右前肢伸展為1分（輕度異常）;左前肢貼在胸前，上半身卷曲為2分（嚴重異常）。

1.6 熒光定量PCR檢測檢測Caspase3和HSP-60 mRNA表達 稱取約20 mg相同位置的腦組織，加入Trizol裂解液1 mL，組織勻漿，RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA。按Takara逆轉錄試劑盒說明書操作進行逆轉錄合成cDNA。然后應用SYBR Green I嵌合熒光法在實時定量PCR儀胞Caspase3和HSP-60表達檢測，相關引物由上海生物工程有限公司合成公司合成。在PCR反應程序結束后，進入儀器自帶軟件的數據分析界面，設置GAPDH為內參基因，儀器自動計算出各實驗組基因表達差異倍數及標準差，即2-△△Ct±標準差值。特異基因引物系列如下：

Caspase3：（Forward Primer）5′-GTACAGAGCTGGACTGCGGTATTG-3′

（Reverse Primer）5′-AGTCGGCCTCCACTGGTATCTTC-3′

HSP-60：（Forward Primer）5′-CACCACTGCCACTGTTCTGG-3′

（Reverse Primer）5′-GCCAACATCACACCTCTCCG-3′

β-actin：（Forward Primer）5′-TCAGGTCATCACTATGGCAAT-3′-3′

（Reverse Primer）5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′

1.7 統計學分析 本次研究采用 SPSS12.0 統計軟件處理，實驗數據用均數加減標準差表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，α=0.05為顯著性檢驗性水準。

2 結果

2.1 針刺對腦梗死大鼠神經功能的影響 采用改良的Longa五點量表評分系統，評定動物神經功能缺損。每次評分3次，取平均值。分值越高，動物的行為障礙越嚴重。結果顯示，干預12h，電針非經非穴組、電針穴位組、艾灸穴位組大鼠神經功能均低于模型組，差異有統計學意義。見表1。

2.2 針刺對腦梗死大鼠HSP60 mRNA基因表達水平的影響 熒光定量PCR檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組HSP60 mRNA表達顯著降低，與模型組比較，電針穴位組大鼠HSP60 mRNA顯著增加，差異有顯著性意義（P<0.05）。而電針非經非穴組和艾灸穴位組無顯著的變化（P>0.05）。見表2。

2.3 針刺對腦梗死大鼠Caspase-3 mRNA基因表達水平的影響 檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組Caspase-3 mRNA基因表達水平上升。與模型組比較，電針非經非穴組、電針穴位組、艾灸穴位組大鼠Caspase-3 mRNA基因表達水平無明顯變化（P>0.05）。見表3。

3 討論

缺血性腦中風（腦梗死）仍是當今疾病中主要的致殘、致死原因，嚴重威脅人類的健康，并給家庭和社會帶來了很大的負擔。近年來，越來越多的患者認可針刺治療腦梗死的療效，其治療的機制也成為研究熱點。針刺療法是中國傳統醫學中一顆璀璨的明珠，有著悠久的歷史，黃帝內經、針灸甲乙經等經典對針刺治療腦中風均有記載，已有實驗研究提示針刺可減少興奮性氨基酸釋放、增加腦血流、升高超氧化物歧化酶（SOD），同時降低血清脂質過氧化物（LPO）、加速清除自由基和腦細胞功能的修復等作用[3-4]。本研究結果顯示電針干預12h，電針干預組大鼠神經功能均低于模型組，提示電針對腦中動脈線栓誘導腦缺血再灌注損傷模型具有較好的治療作用，其相關的作用機制值得進一步研究。

神經細胞凋亡的重要原因之一是線粒體凋亡傳導通路的激活，其與缺血性腦卒中疾病的發生密切相關[6]。目前抗神經細胞凋亡實驗研究的靶點主要是保護線粒體結構和功能。腦中風（腦梗死）發病的特點是起病早，興奮性氨基酸毒性引起神經元損傷。細胞死亡的早期階段觸發炎癥反應，通過凋亡機制加重神經元損傷。Caspase-3介導的細胞死亡以及Caspase 無關的凋亡信號通路可由MCAO激活，導致梗死核心壞死，加重神經元損傷[7]，其與缺血性腦卒中疾病的發生密切相關。

目前抗神經細胞凋亡實驗研究的靶點主要是保護線粒體結構和功能。細胞凋亡的重要途徑之一是線粒體凋亡通路，線粒體釋放促凋亡因子進入胞漿隨即線粒體凋亡通路啟動，當線粒體釋放細胞色素C到細胞漿后，線粒體通路激活后，繼而啟動Caspase-9激活，繼續激活Caspase-3，從而導致Caspase的級聯反應，最終促使細胞凋亡的發生[2-3]。熱休克蛋白在細胞凋亡中具有復雜的作用，但主要是抗凋亡[8]，它們的抗凋亡作用的統一特征是抑制蛋白水解成熟和/或胱天蛋白酶的活性，以及裂解其靶底物，包括粘著斑激酶（FAK）和PARP有研究指出：HSP60作為熱休克蛋白家族中重要成員之一，在細胞凋亡過程中有其較強關聯性[4]。研究表明，HSP60表達的減少會促進細胞凋亡，但不會改變線粒體功能。

本研究通過熒光定量PCR檢測HSP60表達情況。結果顯示，電針穴位組大鼠HSP60 mRNA顯著增加，提示電針可能通過增加HSP mRNA表達，發揮HSP抗凋亡的作用，抑制神經細胞發生凋亡，從而發揮缺血性腦損傷的保護作用。為進一步研究HSP60對凋亡信號通路干預環節，我們進一步研究檢測Caspase-3 mRNA表達。結果顯示，電針對腦梗死大鼠Caspase-3 mRNA基因表達水平無明顯變化，提示電針可能不作用在Caspase級聯反應，推測可能結合胞質中Bax、Bak或Bcl2家族，形成復合物從而發揮抗凋亡效應，確切的作用機制有待進一步研究。

參考文獻：

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