HPLC法一測(cè)多評(píng)法對(duì)補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑中人參、三七的含量測(cè)定研究

牟娟 李健田 毛子春

摘要：目的 創(chuàng)建應(yīng)用HPLC法對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑” 中含有的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1（后文稱“4種皂苷”）進(jìn)行含量測(cè)定的方法。方法 采用HPLC法。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（長(zhǎng)度：250 mm，直徑：4.6 mm，孔徑：5μm），P.N.959990—902。柱溫：30℃。流速：1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。進(jìn)樣量：10μL。流動(dòng)相：水（A）—乙腈（B），程序洗脫。結(jié)果 三七皂苷R1：線性關(guān)系在0.0829—2.0454μg范圍內(nèi)良好（R=0.9995）。平均加樣回收率為：95.17%（RSD為0.65%，n為6）。人參皂苷Rg1：線性關(guān)系在0.2944—5.1263μg范圍內(nèi)良好（R=0.9999）。平均加樣回收率為：96.81%（RSD為1.17%，n為6）。人參皂苷Rf：線性關(guān)系在0.0039—0.0586μg范圍內(nèi)良好（R=0.9993）。平均加樣回收率為：104.05%（RSD為1.78%，n為6）。人參皂苷Rb1：線性關(guān)系在0.2350—3.5256μg范圍內(nèi)良好（R=0.9999）。平均加樣回收率為：96.61%（RSD為1.33%，n為6）。結(jié)論 創(chuàng)建了應(yīng)用HPLC法對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”中含有的4種皂苷進(jìn)行含量測(cè)定的可信度較高的方法。

關(guān)鍵詞：三七皂苷R1;含量測(cè)定;人參皂苷Rg1;人參皂苷Rf;補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑;人參皂苷Rb1;HPLC法

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2021）05-0073-05

“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”系醫(yī)院多年使用協(xié)定處方，臨床效果顯著。方中使用了“三七”、“人參”兩味藥材;具有“活血益氣，補(bǔ)肝腎”等功效。《中國(guó)藥典》（2015年版）一部收載的“三七”藥材，載有“散瘀止血，消腫止痛”等功效;“人參”載有“生津養(yǎng)血”等功效[1]。“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”目前在標(biāo)準(zhǔn)制訂研究階段，使用HPLC法對(duì)補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑中人參、三七含有的4種皂苷進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”作進(jìn)質(zhì)量控制。對(duì)色譜條件、提取方法等進(jìn)行考察，來(lái)確保實(shí)驗(yàn)方法的可靠性、準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（四元泵，DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器），Agilent1260化學(xué)工作站;萬(wàn)分之一分析天平（賽多利斯BP211D-OCE）。

1.2 試藥 補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑（醫(yī)院自制）;人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201128，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以91.1%計(jì)）;人參皂苷Rf標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110719-201505，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110704-201726，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以92.4%計(jì)）三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110745-201128318，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以94.0%計(jì)）;乙腈、甲醇（色譜純）;其他化學(xué)試劑為分析純;水為超純水。

2 方法條件選擇與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 需要檢測(cè)的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑中含有的這4種皂苷主要來(lái)自處方中的三七和人參，本實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為203nm。是參考《中國(guó)藥典》（2015年版）一部収載的用HPLC法測(cè)定“三七”、“人參”中這4種皂苷的含量的方法。

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 流動(dòng)相 本次實(shí)驗(yàn)首先參考《參考《中國(guó)藥典》（2015年版）一部収載的“三七”、“人參”標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定時(shí)的流動(dòng)相。開展后對(duì)梯度洗脫的流動(dòng)相比例以及比例轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行了一系列的探索[11]，最終篩選出適合此次實(shí)驗(yàn)的如“表1”所示的梯度洗脫程序。使用其他條件洗脫程序，出現(xiàn)樣品中目標(biāo)物質(zhì)的吸收峰均分不開，有相鄰的吸收峰合并等問(wèn)題。

2.2.2 柱溫 設(shè)置25、27、30℃進(jìn)行篩選[10]，25、27℃目標(biāo)物質(zhì)的分離度小于1.5。柱溫為30℃時(shí)，分離度才達(dá)到要求，柱溫確定30℃。

2.2.3 色譜柱 多次實(shí)驗(yàn)確定使用ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，分離效果好達(dá)到要求。

3 溶液的配制

3.1 樣品溶液的準(zhǔn)備 使用不同的溶劑如三氯甲烷、乙醚、水飽和的正丁醇等提取，采取大孔樹脂柱、氨試液等方法洗脫雜質(zhì)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反復(fù)對(duì)比、優(yōu)化最終確認(rèn)樣品制備方法如下。

精密量取樣品10 mL，用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，棄去三氯甲烷液。再用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL;合并水飽和的正丁醇液，再用氨試液60 mL萃取，棄去氨試液;再取適量水飽和的正丁醇來(lái)洗滌分液漏斗，收集洗滌液。合并水飽和的正丁醇液于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干。殘?jiān)眉状既芙庵?0 mL容量瓶，甲醇定容至刻度、搖勻、濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的準(zhǔn)備 分別精密稱取一定質(zhì)量4種皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇使其溶解于適當(dāng)?shù)娜萘科俊Ｔ儆眉状级ㄈ葜量潭龋瞥梢欢舛鹊摹皢我怀煞謽?biāo)準(zhǔn)品溶液”。精密量取一定體積上述“單一成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液”于同一適當(dāng)?shù)娜萘科浚状级ㄈ葜量潭取Ｗ鳛椤盎旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液”。。

3.3 陰性對(duì)照溶液的準(zhǔn)備 根據(jù)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”的處方。只去除“三七”、“人參”藥材。其他的條件不變。按“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”的制作方法制作。制成“缺三七和人參的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”。按“3.1”項(xiàng)制備，來(lái)作為陰性對(duì)照溶液。

4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（長(zhǎng)度： ?[LL]250 mm，直徑：4.6 mm，孔徑：5μm），P.N.959990—902。柱溫：30℃。流速：1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。進(jìn)樣量：10μL。流動(dòng)相：水（A）—乙腈（B）。按“表1”中程序進(jìn)行梯度洗脫。三七皂苷R1的保留時(shí)間為32.75 min。人參皂苷Rg1的保留時(shí)間為44.91 min。人參皂苷Rf的保留時(shí)間為69.85 min。人參皂苷Rb1的保留時(shí)間為87.41 min。分離度均大于1.5。缺三七、缺人參的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑作為陰性對(duì)照。在32.75、44.91、69.85、87.41 min處無(wú)吸收峰干擾。如“圖1”所示。

5 方法學(xué)研究

5.1 專屬性考察 按照上述色譜條件，分別取3.1、3.2、3.3項(xiàng)下溶液進(jìn)樣，采集色譜圖（見圖1），由圖可知，陰性對(duì)照色譜（缺三七、人參）在對(duì)照品相應(yīng)出峰位置上處無(wú)干擾峰，對(duì)測(cè)定干擾小，系統(tǒng)誤差小;對(duì)照品、樣品色譜圖（Rt=32.75、44.91、69.85、87.41 min）分離效果良好，本實(shí)驗(yàn)方法專屬性強(qiáng)。

Ⅰ：4種皂苷的混合對(duì)照.Ⅱ：補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑樣品.Ⅲ：缺三七和人參的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑.

5.2 線性關(guān)系考察 用 上述確定的色譜條件。測(cè)定不同濃度的混合對(duì)照品。以三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-10]。結(jié)果如“表2”、“圖2”所示。以人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如“表3”、“圖3”所示。以人參皂苷Rf標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如“表4”、“圖4”所示。以人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如“表5”、“圖5”所示。回歸方程為：三七皂苷R1：y=407.18x-3.6129，線性關(guān)系在0.0829—2.0454μg范圍內(nèi)良好（R=0.9995）。人參皂苷Rg1：y=504.32x+31.652，線性關(guān)系在0.2944—5.1263μg范圍內(nèi)良好（R=0.9999）。人參皂苷Rf：y=498.04x+1.4303，線性關(guān)系在0.0039—0.0586μg范圍內(nèi)良好（R=0.9993）。人參皂苷Rb1：y=429x+0.1306，線性關(guān)系在0.2350—3.5256μg范圍內(nèi)良好（R=0.9999）。

5.3 穩(wěn)定性考察 用準(zhǔn)備好的同一樣品溶液，用上述的色譜條件。分別在0、2、4、8、24h進(jìn)樣。來(lái)測(cè)定樣品中含有的4種皂苷的峰面積。計(jì)算4種皂苷峰面積的RSD如“表6”所示。依次為：三七皂苷R1為1.44%。人參皂苷Rg1為0.49%。人參皂苷Rf為1.53%。人參皂苷Rb1為0.69%。說(shuō)明了樣品溶液在24h內(nèi)比較穩(wěn)定。

5.4 精密度試驗(yàn) 用“混合對(duì)照品溶液”。按上述的色譜條件。測(cè)定4種皂苷的吸收峰面積。連續(xù)測(cè)定6次。然后計(jì)算4種皂苷的峰面積RSD如“表7”所示。依次為：三七皂苷R1為0.86%。人參皂苷Rg1為0.57%。人參皂苷Rf為1.41%。人參皂苷Rb1為0.62%。說(shuō)明了使用“2.1”的色譜條件。該儀器的精密度比較良好。

5.5 重復(fù)性考察 用準(zhǔn)備好的同一批次的6份樣品溶液，用上述的色譜條件。檢測(cè)4種皂苷的峰面積。計(jì)算他們的平均含量及RSD值如“表8”所示。結(jié)果依次為：三七皂苷：含量=0.0847 mg/mL，RSD=1.45%。人參皂苷Rg1：含量=0.3246 mg/mL，RSD=0.98%。人參皂苷Rf：含量=0.0033 mg/mL，RSD=1.49%。人參皂苷Rb1：含量=0.3087 mg/mL，RSD=0.97%。說(shuō)明此次實(shí)驗(yàn)的方法具有比較良好的重復(fù)性。

5.6 加樣回收率考察 精密量取5 mL已知含量的樣品于分液漏斗中。再精密量取適量的“混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液”加入其中。按“3.1”樣品溶液的準(zhǔn)備方法，準(zhǔn)備6份溶液。作為加樣回收試驗(yàn)的溶液。用上述的色譜條件。進(jìn)行吸收峰面積的檢測(cè)。然后計(jì)算平均加樣回收率如“表9”、“表10”、“表11”、“表12”所示。

5.7 供試品含量測(cè)定 用3個(gè)批次的樣品按“3.1”樣品溶液的準(zhǔn)備方法，各準(zhǔn)備2份樣品溶液。采用上述的色譜條件。對(duì)樣品中含有的4種皂苷峰面積進(jìn)行了2次檢測(cè)。然后計(jì)算出他們的平均含量如“表13”所示。

6 結(jié)論

本試驗(yàn)采用DAD UV HPLC色譜法測(cè)定樣品中 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1的含量，本檢驗(yàn)方法得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)為0.9999，精密度的RSD值小于1.5%，重復(fù)性的RSD值0.4%，加標(biāo)回收率在95.0%～105.0%間。該方法適用“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”中含有4種皂苷的含量測(cè)定。可信度較高，對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”的標(biāo)準(zhǔn)起草及質(zhì)量控制有著重要的意義。

7 討論

對(duì)處方中同時(shí)調(diào)配三七和人參2味中藥情況，無(wú)論是在制劑還是臨床方劑中不多見。在常見的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中三七含量測(cè)定成分為人參皂甙Rb1、Rg1、三七皂甙R1三者總和，三七皂甙R1為三七鑒別的專屬性指標(biāo)成分;人參含量測(cè)定成分為人參皂甙Rg1、Rb1、Re三者總和，人參皂甙Rf為人參鑒別的專屬性指標(biāo)成分。本次實(shí)驗(yàn)研究在選取含量測(cè)定控制指標(biāo)性成分時(shí)選定三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf 四個(gè)對(duì)照物質(zhì)進(jìn)行控制，便于對(duì)處方中的三七和人參質(zhì)量控制。但因在同一方法中控制指標(biāo)多，在樣品分離度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等方面要求高、難度較大;對(duì)檢測(cè)設(shè)備的性能要求較高。

對(duì)樣品提取環(huán)節(jié)也有要求，皂苷類物質(zhì)在溶液中穩(wěn)定性不高容易發(fā)生分解。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究階段可以通過(guò)精細(xì)控制達(dá)到不同批次樣品差異性不大。但在中試及大生產(chǎn)過(guò)程中不易控制，須在藥品研發(fā)生產(chǎn)工藝時(shí)總體控制調(diào)節(jié)：如調(diào)節(jié)溶液pH值、在提取環(huán)節(jié)進(jìn)一步純化中間品等，進(jìn)一步改善藥品的穩(wěn)定性。

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