基于網絡藥理學探討溫膽湯治療哮喘作用機制?

楊 陽 張 迪 王 佳 黃程程 王有鵬

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150001）

哮喘是兒童最常見的慢性呼吸系統疾病，其特征是慢性氣道炎癥、可逆性氣道阻塞、氣道重塑、黏液分泌增加和氣道高反應性［1］。哮喘發作的常見誘因包括病毒感染、暴露于過敏原和（或）污染物、吸煙、突然的溫度變化、壓力和運動等［2-3］。目前，全球約有3.34億人和10%的兒童受到影響，構成了嚴重的全球健康問題［4-6］。近年哮喘的發病率不斷上升，預計2025年可達4億［7-8］。中醫中藥治療兒童疾病優勢近年來受到重視，很多學者也開始深入研究經典方劑治療哮喘的作用機制，不但可以更好地治療疾病，還為醫學研究提供理論基礎。

溫膽湯最早記載于南北朝時期醫家姚僧垣的《集驗方》［9-10］，不同醫家對其方義闡釋不同，主要包括清熱化痰、解郁化痰、達膽和胃、和胃降膽以及分消走泄等功效。現代醫家對溫膽湯的應用非常廣泛，尤其在治療兒童疾病中應用越來越多，對過敏性疾病的防治效果頗佳，已有臨床觀察證實溫膽湯加減可以治療兒童哮喘。有關實驗對溫膽湯中的成分進行測定，發現其中有部分成分可以用于治療哮喘［11］。筆者通過網絡藥理學對溫膽湯主要成分治療哮喘進行探討，通過構建網絡，獲得溫膽湯治療哮喘可能的作用機制，為后續實驗研究提供理論依據。

1 研究方法

1.1 獲取溫膽湯中主要中藥有效成分及藥物靶點使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選溫膽湯中主要藥物的活性化合物，分別輸入“半夏”“陳皮”“茯苓”“枳實”，篩選標準為：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug like，DL）≥0.18。

1.2 檢索哮喘靶點基因 分別在Gene Cards（https：//www.geneca-rds.org/）和在線人類孟德爾遺傳（OMIM，https：//omim.org/）中輸入“asthma”進行檢索，并將兩個表格進行整合。

1.3 溫膽湯藥物活性成分-核心靶點網絡和PPI網絡構建 將“1.1”獲得的溫膽湯主要藥物的活性成分及核心靶點相關信息導入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯活性成分-核心靶點網絡。使用STRING平臺（https：//string-db.org/）可以構建蛋白互作網絡。

1.4 GO分析 使用R語言軟件對溫膽湯主要藥物與哮喘的共作靶點進行數據的處理，并得到GO分析的條形圖、氣泡圖。使用Perl將轉換的ID變成原始基因靶點。

1.5 KEGG通路富集分析及KEGG關系網絡構建 將獲得的ID轉換文本文件，運行R語言得到KEGG通路富集分析的條形圖、氣泡圖及文本文件。使用perl對獲得的KEGG文本文件進行操作，輸入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯與哮喘直接的KEGG關系網絡。

2 結 果

2.1 溫膽湯主要藥物的活性成分 經過TCMSP篩選后得到溫膽湯主要藥物的有效活性成分52個，其中半夏13個，陳皮5個，茯苓15個，枳實22個，陳皮、枳實共有3個，整合后可獲取藥物有效活性成分作用靶點603個。

2.2 潛在靶點信息 通過Gene Cards獲得哮喘的靶點基因5 974個，通過OMIM獲得哮喘靶點基因36個，將已經獲得的溫膽湯中活性成分作用的靶點基因取交集，可獲得兩者的共同靶點有131個。

2.3 溫膽湯主要藥物中活性成分-核心靶點網絡 應用Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯主要藥物活性成分-核心靶點網絡（如圖1），三角形代表靶點，橢圓形代表活性成分，其中藍色代表半夏，綠色代表陳皮，紫色代表茯苓，黃色代表枳實，紅色代表多味藥共同含有。連線越密集的節點越重要。將獲得的131個靶點輸入STRING數據庫，構建PPI網絡，見圖2，并運用R語言提取PPI網絡中度值中心性較高的前30位的核心基因，見圖3。

圖1 溫膽湯主要藥物中活性成分-核心靶點網絡

圖2 溫膽湯與哮喘靶點PPI網絡

圖3 PPI的核心基因

2.4 GO富集分析 分析經R語言運行后總共得到135個功能，獲取其中前20個的GO功能富集的條形圖和氣泡圖（見圖4、圖5）：富集越是顯著顏色越偏紅色，富集越少顏色越偏藍色；橫坐標表示富集數目。

圖4 溫膽湯治療哮喘候選靶點的GO富集條形圖

圖5 溫膽湯治療哮喘候選靶點的GO富集氣泡圖

2.5 KEGG通路富集分析及KEGG關系網絡構建 使用R語言軟件對獲得的131個靶點基因進行KEGG通路富集分析，運行后得到30條通路。繪制顯著性前20的通路的條形圖和氣泡圖（見圖6、圖7）：橫坐標表示靶點數，左邊表示通路名稱，通路上靶點數越多顏色越偏紅色，靶點數越少顏色越偏藍色。通過對富集前20的KEGG通路與基因之間的網絡圖（見圖8）：三角形代表通路，橢圓形代表基因，線代表相互鏈接，圖形越大代表相互關聯數量越多。

圖6 溫膽湯-哮喘潛在靶點KEGG通路條形圖

圖7 溫膽湯-哮喘潛在靶點KEGG通路氣泡圖

圖8 溫膽湯治療哮喘的KEGG關系網絡

3 討 論

哮喘可歸為中醫學的“哮證”“喘證”等范疇。在《素問·陰陽別論》中“陰爭于內，陽擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”，對哮喘的病因和癥狀進行描述。后世《金匱要略》“咳而上氣，喉中水雞聲”，進一步對癥狀及治療進行記載。近現代中醫學者對哮喘的認識更深入，對病因病機的不斷完善，治療上面的選方用藥更系統化、多樣化、全面化。通過溫膽湯加味治療哮喘的臨床觀察可以看出，其治療哮喘具有一定的療效，但是對于機制的研究尚未廣泛開展。

通過對溫膽湯中的有效成分進行分析，部分化合物已經證實具有治療哮喘的作用，尤其是一些與基因關聯較多的活性成分，比如木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇等。木樨草素具有抑制哮喘氣道重塑及抑制哮喘氣道炎癥的作用［12］。β-谷甾醇具有抑菌抗炎的作用，多個治療哮喘的藥物都含有此成分［13-14］。柚皮素具有止咳化痰平喘的作用［15］。豆甾醇對哮喘氣道炎癥具有調節作用［16］。

通過對溫膽湯與哮喘的PPI網絡分析，核心基因為Akt1、MAPK3、IL-6、VEGFA、FOS、JUN、MAPK1等。查閱文獻可知，AKT1的磷酸化變化可能在治療哮喘的療效中起重要作用［17］。MAPK3與MAPK1在MAPK信號通路中具有重要的作用，與調控氣管平滑肌細胞炎癥基因表達的重要信號酶相關［18］，MAPK信號通路與溫膽湯治療哮喘也具有相關性。IL-6近年被證實是哮喘的易感基因［19-20］。VEGFA在哮喘發病中起作用，如嗜酸性炎癥、杯狀細胞化生、氣道重塑以及氣道高反應性，被認為是哮喘發病的關鍵介質之一［21］。FOS與JUN等基因都參與了哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應等，從而使哮喘誘發或嚴重［22］。已有文獻證明，溫膽湯對某些疾病的患者或實驗動物血清中的炎癥因子IL-6、VEGFA等有調節作用，可調節組織中FOS及JUN等基因的表達。目前關于溫膽湯治療哮喘的動物實驗研究較少，分析獲得的基因將是后期實驗的主要研究對象。

GO富集分析顯示GO功能富集后富集數目較多的有泛素樣蛋白連接酶結合、DNA結合轉錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結合等。真核生物中泛素樣蛋白連接酶在許多細胞功能中起著核心作用，但目前針對其與哮喘的研究較少。磷酸酶是許多細胞信號傳遞的關鍵，可以激活信號通路，使其表現功能。可推測溫膽湯通過參與多途徑治療哮喘，尤其是在細胞免疫等方面。淋巴細胞的失衡是哮喘發病機制的主要原因之一，免疫細胞參與哮喘的發病、發生、發展及治療。合理選擇中藥復方可以更好地通過細胞免疫等方面改善哮喘癥狀，不但使中藥治療疾病效果更佳，還可以通過實驗數據使中醫藥更具有說服力和應用空間。

KEGG富集通路分析顯示溫膽湯治療哮喘主要通路有PI3K-Akt信號通路、內分泌抵抗、細胞凋亡、cAMP信號通路等通路為主；KEGG通路與基因之間的網絡圖中關聯數量較多的基因主要有MAPK3、MAPK1、Akt1等。其中，最新研究表明，通過靶向PI3K/Akt整合素軸的氣道上皮修復是治療兒童喘息和哮喘的新途徑［23］。哮喘發生主要的因素是氣道炎癥與氣道重塑及氣道高反應等，PI3K-Akt通路不但可以減輕氣道炎癥，還可以抑制氣道重塑，從而改善哮喘癥狀。氣道細胞凋亡的積聚可能是導致氣道高反應性的重要因素。凋亡細胞能否及時清除與哮喘的發生和病程有關［24］。研究發現，cAMP信號通路在多系統及細胞代謝等方面發揮著重要作用，其中某些基因的異常表達與哮喘病理生理的變化過程具有重要關聯［25］。還有文獻表明，該通路可能是肺腸同治哮喘的物質基礎之一［26］。

本文通過網絡藥理學對溫膽湯治療哮喘進展分析，推測其可能是通過多成分、多靶點、多通路的相互關系進行作用，可進一步針對其影響氣道重塑、信號傳導和免疫代謝等方面進行實驗證實。溫膽湯治療哮喘的作用機制PI3K-Akt、cAMP等信號通路可能有關，作用于MAPK3、MAPK1、Akt1等相關受體。目前關于其中的機制研究較少，盡管以上結論是通過查閱數據庫所得，仍可為科研實驗提供了新思路。本次獲得信號通路可能就是溫膽湯治療哮喘的主要通路，后期可通過實驗對通路及相關因子進行驗證，以期為中醫藥的發展提供更好的基礎理論依據，為中醫藥的蓬勃發展做貢獻。