銀杏內酯B對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用?

柴麗娜 杜 蕊 張艷艷 孫瑩瑩 梁衛章 欒紹華 關連穎 任 亮 劉津軍

（1.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001；2.河北省冀中能源峰峰集團總醫院，河北邯鄲 056200）

心臟缺血再灌注損傷是急性心肌梗死溶栓后及多種心臟手術術后常見并發癥，嚴重影響患者預后，是臨床上亟待解決的難題。銀杏內酯B是我國傳統中藥銀杏葉的主要活性成分之一，既往研究發現銀杏內酯B具有抗氧化、抗炎以及抑制細胞凋亡等多種藥理學作用［1-3］，但關于銀杏內酯B對心肌缺血再灌注損傷保護作用的文獻報道尚不多見。本實驗采用Langendorff灌流系統，建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，以維拉帕米為陽性對照藥物，研究銀杏內酯B對離體心臟的保護作用并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠（8周齡，220～260 g）購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。飼養環境：23～25℃、相對濕度55%～60%，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器 銀杏內酯B購自美國Sigma公司（批號：33570）；維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司（批號：43170116）；TTC購自美國Sigma公司（批號：M2128）；HE試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：161029）；谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司（批號：170101018、161209011、170117008）；SOD、CAT、MDA、Na+-ATP、Ca2+-ATP試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：161207、161124、160916、170118、160910）；K-H 液 ：用 NaCl 20.67 g、NaHCO36.27g、KCl 1.05 g、KH2PO40.48 g、Glu?cose 5.99 g、MgSO4·7H2O 0.87 g、CaCl20.85 g溶解于1 L蒸餾水，調節pH=7.40（自制）。主要儀器：Langen?dorff離體心臟灌流系統（美國Radnoti公司）；Medlab/8C生物信號采集系統（南京美易科技有限公司）；BI-2000醫用圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）；紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）；生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

1.3 分組與造模 將100只大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、銀杏內酯B（15、30、60 mg/kg）組和維拉帕米組（陽性藥物對照組），各20只。手術前2 h，銀杏內酯B各劑量組和維拉帕米組分別腹腔注射相應藥物，正常對照組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。參照郭麗麗等報道的實驗方法制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型：腹腔注射20%烏拉坦麻醉后，迅速開胸，切斷主動脈后取出心臟，置預冷（4℃）K-H液中，分離主動脈，釆用Langendorff法逆灌含氧K-H液（充以95% O2+5% CO2），切開左心耳并由此置入帶測壓導管的球囊，測壓導管連接生物信號采集系統［4］。正常對照組持續以7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）110 min，模型組、銀杏內酯B各劑量組和維拉帕米組依次行7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）20 min、停灌30 min后恢復灌注60 min，然后取材行各指標檢測。

1.4 標本采集與檢測 1）心肌酶（AST、LDH、CKMB）活性檢測。分別取各組大鼠心臟冠脈流出液，采用生化分析法檢測心肌酶AST、LDH、CK-MB活性。2）TTC染色法測定心臟組織梗死面積。每組隨機選取6只大鼠離體心臟，-20℃凍存20 min，置于2% TTC溶液恒溫（37℃）、避光孵育15 min，紅色為正常組織、灰白色為梗死區，通過醫用圖像分析系統計算梗死面積百分率。3）HE染色法觀察心臟組織病變。每組另隨機取6只大鼠離體心臟，置4%多聚甲醛溶液固定72 h，經常規脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，按照染色試劑盒操作步驟行HE染色，然后通過倒置光學顯微鏡觀察心臟組織病變。4）血流動力學指標檢測。通過連接測壓導管的生物信號采集系統記錄各組大鼠離體心臟組織心率（HR）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮壓（LVSP）、左室收縮壓最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒張壓最大下降速率（-dP/dtmin）。5）心臟組織抗氧化酶活性檢測。取各組剩余的8只大鼠離體心臟組織，于4℃環境剪碎，加入適量冷裂解液后研磨勻漿，制備10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min取上清液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計檢測心臟組織中抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）含量以及Na+-ATP、Ca2+-ATP活性。

2 結 果

2.1 各組心肌酶活性比較 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶AST、LDH、CK-MB活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組冠脈流出液AST、LDH、CK-MB活性顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶活性比較（U/L±s）

表1 各組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶活性比較（U/L±s）

與正常對照組比較，??P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

組別正常對照組模型組銀杏內酯B 15 mg/kg組銀杏內酯B 30 mg/kg組銀杏內酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n 20 20 20 20 20 20 AST 9.75±2.08 64.03±14.90**53.97±14.31 27.40±5.86△△15.77±4.21△△39.85±14.06△LDH 8.62±2.58 91.87±14.95**73.70±13.94△48.31±11.63△△26.29±8.22△△54.11±13.24△△CK-MB 679.64±75.23 1789.25±271.80**1514.17±208.16 1091.64±185.11△985.08±171.29△△1079.58±187.37△

2.2 各組心肌組織梗死面積百分率比較 見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠離體心肌組織梗死面積百分率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組心肌組織梗死百分率顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積比較（%±s）

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積比較（%±s）

組別正常對照組模型組銀杏內酯B 15 mg/kg組銀杏內酯B 30 mg/kg組銀杏內酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n 6 6 6 6 6 6梗死百分率0.00±0.00 41.97±5.02**38.39±5.40 31.75±5.27△22.96±4.19△△30.98±4.86△

2.3 各組心臟組織病變觀察結果 見圖1。正常對照組大鼠離體心臟組織細胞形態未見異常；模型組心臟組織呈現肌原纖維斷裂、間隙增寬、排列紊亂，細胞空泡變性、細胞質著色不均、胞核深染等病變；較模型組，銀杏內酯B 15、30、60 mg/kg組和維拉帕米2.5 mg/kg組離體心臟組織病變呈現不同程度改善，其中以60 mg/kg組效果較為顯著。

圖1 各組大鼠離體心臟組織形態（HE染色，200倍）

2.4 各組血流動力學指標比較 見表3。與正常對照組比較，模型組大鼠離體心臟血流動力學指標（HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin）顯著下降而LVEDP顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米2.5 mg/kg組HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin顯著升高且LVEDP顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠離體心臟血流動力學指標（±s）

表3 各組大鼠離體心臟血流動力學指標（±s）

注：1 mmHg≈0.133 kPa。

組別正常對照組模型組銀杏內酯B 15 mg/kg組銀杏內酯B 30 mg/kg組銀杏內酯B 60 mg/kg組維拉帕米組LVSP（mmHg）86.86±9.80 61.14±9.57**63.76±9.81 72.05±9.59△78.68±10.24△△74.31±10.19△n 20 20 20 20 20 20 HR（次/min）276.85±27.41 243.08±23.79**251.03±23.68 261.15±24.31△267.69±26.08△264.98±24.10△LVEDP（mmHg）7.32±2.28 35.26±9.39**26.10±6.18 21.42±5.27△16.75±4.60△△18.65±5.03△+dP/dtmax（mmHg/s）2398.26±324.41 956.87±195.94**1045.90±213.61 1469.06±234.30△1761.83±275.17△△1692.86±219.76△△-dP/dtmin（mmHg/s）1923.85±275.70 781.90±194.16**897.42±202.76 1141.72±229.28△1493.05±243.71△△1415.98±220.15△△

2.5 各組抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量比較見表4。與正常對照組比較，模型組大鼠離體心臟組織SOD、CAT顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組SOD、CAT活性顯著升高（P<0.05或P<0.01），MDA含量顯著降低（P<0.01）。

表4 各組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性及MDA含量比較（±s）

表4 各組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性及MDA含量比較（±s）

組別正常對照組模型組銀杏內酯B 15 mg/kg組銀杏內酯B 30 mg/kg組銀杏內酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n 8 8 8 8 8 8 SOD（U/mg）67.93±5.08 37.40±3.99**41.27±4.65 48.83±5.11△57.89±5.64△△49.05±5.31△CAT（U/mg）37.51±4.72 16.38±3.43**20.30±3.75 24.12±3.40△31.05±4.38△21.97±4.26 MDA（nmol/mg）3.71±0.69 9.76±1.68**8.22±1.52 6.49±1.41△△5.53±0.99△△6.78±1.20△△

2.6 各組Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比較 見表5。與正常對照組比較，模型組大鼠離體心臟組織Na+-ATP、Ca2+-ATPase活力顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表5 各組大鼠離體心臟Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比較［μmoL/（mg·h）±s］

表5 各組大鼠離體心臟Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比較［μmoL/（mg·h）±s］

組別正常對照組模型組銀杏內酯B 15 mg/kg組銀杏內酯B 30 mg/kg組銀杏內酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n888888 Na+-ATPase 1.68±0.76 0.75±0.19**0.84±0.28 1.50±0.37△1.93±0.65△△1.91±0.72△△Ca2+-ATPase 1.49±0.41 0.65±0.22**0.97±0.36 1.33±0.40△△1.79±0.42△△1.84±0.41△△

3 討 論

隨著高血壓病、高脂血癥等患病人群的擴大，冠心病以及由其所引發的急性心肌梗死發病率逐年升高，嚴重危害著人類的生命健康。目前，臨床上冠狀動脈再通、恢復血流再灌注是治療缺血性心臟病的首選方案，但缺血再灌注損傷并發癥嚴重影響患者預后。近年來，郭志祥等研究發現血流動力學改變、氧化應激損傷以及ATPase活性降低是心肌缺血再灌注損傷主要病理機制［5-6］，這也為研發能夠有效降低缺血再灌注損傷的新型藥物提供了思路。

銀杏葉是我國傳統中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效。現代藥學研究發現，萜內酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內酯（Ginkgolide）A、B、C、M和白果內酯，其中活性最強的即為銀杏內酯B，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學活性。本實驗釆用Langendorff離體心臟灌流技術，模擬心肌缺血再灌注損傷模型，研究發現經銀杏內酯B預處理能夠有效降低離體心臟冠脈流出液AST、LDH、CK-MB活性、降低心肌組織梗死面積、抑制心肌組織病變，表明銀杏內酯B能夠減輕心肌組織細胞損傷、改善心功能，提示銀杏內酯B對離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

血流動力學指標正常是保證心臟功能的基礎，其中HR、LVEDP、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin是衡量血流動力學的重要指標；其中，HR能夠反應心臟的整體功能，LVEDP能夠反映舒張期左室內壓變化，LVSP反映收縮期左室內壓變化，LVEDP和LVSP能夠體現心肌順應性；+dp/dtmax反映心肌收縮程度、-dp/dtmax反映心肌舒張功能，二者是評價心肌收縮性能和舒張性能的敏感指標［7-8］。心肌缺血/再灌注可降低心肌舒縮功能，表現為心排血量減少及±dp/dtmax指標降低［9］。本研究發現，經銀杏內酯B預處理能夠有效提高離體心臟HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin并降低LVEDP，提示銀杏內酯B具有改善離體心臟缺血再灌注損傷后血流動力學的藥理學作用。

氧化應激損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機制之一［10］，體內氧自由基代謝失衡是氧化應激損傷的病理基礎，SOD、CAT是體內清除氧自由基的關鍵還原酶［11-12］，MDA為脂質過氧化反應終產物，因此SOD、CAT活性和MDA含量能夠間接反應心肌組織損傷的程度［13］。本研究發現，經銀杏內酯B預處理能夠有效改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性并降低MDA含量，提示銀杏內酯B具有抑制離體心臟缺血再灌注后氧化應激損傷的作用。

心肌缺血再灌注將導致細胞內Na+濃度升高，促進Na+-Ca2+交換而導致大量Ca2+內流而致細胞內Ca2+超載［14］，進而引起細胞結構損傷而致細胞死亡，是心臟組織缺血再灌注損傷的另一重要病理機制［15-17］。本實驗研究發現，經銀杏內酯B預處理能夠有效提高Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性，從而有效緩解細胞內Na+、Ca2+超載，這可能是銀杏內酯B對離體心臟缺血再灌注損傷能夠起到一定保護作用的機制之一。

總之，銀杏內酯B能夠減輕心肌組織細胞損傷、改善心功能，提示銀杏內酯B對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，可能與其能夠改善血流動力學、抑制氧化應激損傷以及改善Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性有關。