肺動脈高壓中NF-κB對IL-6表達的調控作用研究

侯微微，張少輝，劉 雙

(1.河南科技大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學第一附屬醫院急診科，河南 洛陽 471003；3.首都醫科大學附屬北京安貞醫院學院/北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

肺動脈高壓是一個復雜、多因素影響的疾病，其特征是肺動脈重構、肺血管阻力升高和右室肥厚[1-2]，但其機制尚不十分清楚。目前認為，免疫和炎癥在肺動脈高壓中起重要作用[3-4]，其中以巨噬細胞、白細胞介素-6(IL-6)及核因子κB(NF-κB)最為突出[5-7]。本研究旨在通過測定肺動脈高壓大鼠肺組織IL-6及NF-κB水平，以及低氧刺激下不同時間段小鼠巨噬細胞IL-6和NF-κB的表達，探討肺動脈高壓中巨噬細胞內NF-κB對IL-6表達的調控作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 本實驗采用健康雄性Sprague-Dawley大鼠(無特定病原體)，鼠齡6周，體重200～240 g，購于中國軍事醫學科學院[許可證號：SCXK-(軍)2007-004]。在首都醫科大學附屬北京安貞醫院實驗動物中心寄養，自由進食飲水，適應性飼養3～4 d后進行實驗。實驗人員已獲得《北京市實驗動物從業人員崗位證書》，動物飼養符合“北京市實驗動物管理條例”和“實驗動物福利倫理審查指南”。

1.2方法

1.2.1肺動脈高壓模型建立與分組 選取體重200～240 g的健康雄性SD大鼠24只，隨機分為對照組、4周組、6周組，每組各8只。對照組頸背部一次性皮下注射0.9%氯化鈉溶液1 mL，飼養4周。配制野百合堿，首先溶于適量1 mol/L鹽酸中，然后以0.1 mol/L氫氧化鈉調節pH至7.4，最后用0.9%氯化鈉液配置成終濃度為20 g/L的溶液。4周組、6周組給予頸背部皮下注射野百合堿(60 mg/kg)1次(注射液體量約為1 mL)，分別飼養4周、6周。實驗動物均給予普通飲食，自由飲水。

1.2.2右心室測壓 對照組、4周組、6周組大鼠均在注射生理鹽水(或野百合堿)后28、42 d稱重，應用戊巴比妥30 mg/kg麻醉后，由劍突下行腹部切口，將頭皮針由腹腔經橫膈膜插入右心室，用BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，測定右心室收縮壓及平均壓。

1.2.3計算右心肥厚指數 測壓完成后經心尖取血，開胸取出心肺。分離心臟，剪去心房及大血管根部，參考JULIAN等[8]和MONGE等[9]介紹的方法，分離右心室和左心室加室間隔：沿房室溝剪去心房及大血管根部，沿室間隔分離右心室、左心室加室間隔，濾紙吸干水分后分別稱重，計算右心室肥厚指數，判斷右心室肥厚程度。

1.2.4組織標本的制備及指標的觀察 肺組織切片后用10%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，制作切片，行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡觀察炎癥細胞浸潤，觀察肺血管周圍淋巴細胞浸潤情況。行肺組織免疫組織化學染色，免疫組織化學過程分別選巨噬細胞CD68、IL-6及NF-κB一抗和相應的二抗做肺組織染色。觀察染色情況。

1.2.5大鼠右肺組織IL-6和NF-κB的mRNA表達檢測 將右肺組織從液氮中取出，應用Trizol液，按流程給予提取、分離、沉淀、洗滌、溶解RNA，測定RNA純度良好，保存RNA。應用Promega-RNA逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA模板鏈。采用Primer 3.0設計實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)所用cDNA引物：NF-κB(大鼠)上游CACCAAAGACCCACCTCACC，下游CCGCATTCAAGTATAGTCCC；IL-6(大鼠)上游CCCACCAGGAACGAAAGTCA，下游GCGGAGAGAAACTTCATAGCTGTT。由生物公司(北京三博遠志生物技術有限公司)進行引物合成。配置PCR反應液，進而給予兩步法PCR擴增程序。目前基因表達采用比較CT值法。

1.2.6低氧誘導小鼠巨噬細胞中IL-6和NF-κB的mRNA表達檢測 采用8周齡健康雄性C57BL/6小鼠脛骨股骨和髂骨分離巨噬細胞，培養5 d后種于6孔板中，缺氧時間分別為0、2、6、12、24、48 h。利用乏氧培養箱(37 ℃恒溫箱內,持續通入94% N2、5%CO2、1%O2的混合氣體)制造細胞缺氧環境，誘導巨噬細胞發生極化。收取上述誘導模型的細胞，應用同上RT-PCR方法測定IL-6及NF-κB的表達。其中，RT-PCR所用cDNA引物為：NF-κB(小鼠)上游CAACACTGCCGAGCTCAAGA，下游CGAGGCAGCTCC CAGAGTT；IL-6(小鼠)上游CTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG，下游AATTAAGCCTCCGACTTGTGAAG。

2 結 果

2.1肺動脈高壓模型建立 大鼠在注射野百合堿后第3周出現體毛暗淡無澤、反應遲鈍、活動度下降，并且大鼠體重較此前下降，4周組大鼠在第25天死亡1只。第6周時部分大鼠出現呼吸急促，呼吸困難，喜站立，在第39、第41天共有2只大鼠死亡。死亡大鼠解剖后可見胸腔、腹腔積液。對照組、4周組、6周組的右心室收縮壓及平均壓逐漸升高，見表1。對照組、4周組、6周組大鼠右心肥厚指數逐漸升高，見表2。對照組、4周組、6周組大鼠右心室收縮壓、平均壓及右心肥厚指數均逐漸升高。4周組、6周組的右心室收縮壓及平均壓、右心肥厚指數均較對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；4周組與6周組上述數據比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2大鼠肺組織中炎癥細胞及炎癥細胞因子 顯微鏡下，野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠肺組織HE染色后，可見大量淋巴細胞浸潤，特別在血管周圍，尤其是外徑大小相近的血管；4周組與6周組大鼠血管壁明顯增厚(圖1)。肺組織免疫組織化學染色后，可見巨噬細胞浸潤增加(圖2)，IL-6和NF-κB高表達，見圖3～4。

表1 3組大鼠收縮壓與平均壓比較

表2 3組大鼠右心肥厚指數比較

A為對照組大鼠肺組織HE染色(400×)；B為4周組大鼠肺組織HE染色(400×)；C為6周組大鼠肺組織HE染色(400×)。

A為對照組巨噬細胞免疫組織化學染色(400×)；B為4周組巨噬細胞免疫組織化學染色(400×)；C為6周組巨噬細胞免疫組織化學染色(400×)。

A為對照組NF-κB免疫組織化學組化染色(400×)；B為4周組NF-κB免疫組織化學組化染色(400×)；C為6周組NF-κB免疫組織化學組化染色(400×)。

A為對照組IL-6免疫組織化學染色(400×)；B為4周組IL-6免疫組織化學染色(400×)；C為6周組IL-6免疫組織化學染色(400×)。

2.3肺組織RT-PCR檢測IL-6和NF-κB表達水平情況 各組大鼠肺組織的RT-PCR結果提示：4周組、6周組肺組織NF-κB的mRNA表達均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；雖然6周組NF-κB的mRNA表達高于4周組，但2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。4周組、6周組肺組織IL-6的mRNA表達均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，但4周組、6周組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。IL-6和NF-κB的mRNA表達在各組大鼠中趨勢相同。見圖5～6。

圖5 肺組織IL-6的mRNA表達圖

圖6 肺組織NF-κB的mRNA表達圖

2.4低氧誘導小鼠巨噬細胞中IL-6和NF-κB的mRNA表達情況 采用相對定量RT-PCR對低氧條件下巨噬細胞IL-6和NF-κB的mRNA表達情況進行分析，結果表明，低氧時間分別為2、6、12、24、48 h的巨噬細胞其IL-6和NF-κB的mRNA表達均高于0 h，且其在各時間段內的表達趨勢相同。見圖7～8。

圖7 低氧條件下不同時間點小鼠巨噬細胞的NF-κB的mRNA表達

圖8 低氧條件下不同時間點小鼠巨噬細胞的IL-6的mRNA表達

3 討 論

野百合堿是常用的肺動脈高壓造模方法。目前研究認為大鼠一次性注射野百合堿2～3周后肺動脈血管就會發生纖維化、硬化，導致肺動脈血管管腔狹窄，血栓形成、阻塞等。第4周時即可出現肺動脈壓力明顯升高，右心室肥厚，同時出現肺動脈中膜增厚、肌化程度增加及內膜增生[10]。本研究中，注射野百合堿的4周組、6周組大鼠3周開始一般情況變差，4周后測右心室壓力及右心肥厚指數均高于對照組，肺組織HE染色后可見4周組、6周組大鼠血管壁明顯增厚，說明造模成功。

目前認為，炎性反應、基因突變、環境及代謝功能改變等均可能參與肺動脈高壓的形成機制[11]。在肺動脈高壓模型中，肺血管周圍可見大量巨噬細胞浸潤[12]。有研究發現，巨噬細胞在肺血管重建的起始和維持中起重要作用[13]。IL-6可由巨噬細胞分泌產生，而IL-6在肺動脈高壓中明顯高表達，并且可能與其預后相關[14]。NF-κB參與許多細胞因子及炎癥細胞因子基因表達的轉錄調控，在炎性反應的細胞因子網絡調節中起關鍵作用。NF-κB激活后，可啟動和調控一系列參與炎性反應的炎癥細胞因子的表達[15]。低氧性肺動脈高壓大鼠實驗中發現，肺組織的NF-κB表達增加[16]。在本研究中，野百合堿誘導肺動脈高壓模型中可見巨噬細胞、NF-κB、IL-6表達增加，在該實驗中NF-κB與IL-6的表達隨大鼠肺高壓的嚴重程度增加而增加，進一步說明兩者在肺動脈高壓中有重要作用。

NF-κB與IL-6之間存在密切關系，低氧增加IL-6的mRNA水平，其可能通過NF-κB/IL-6[17]通路發生。既往研究表明，C反應蛋白(CRP)的致動脈粥樣硬化作用是通過激活NF-κB而介導的[18]。有研究完成了KF-κB途徑介導CRP對肺動脈平滑肌細胞的促炎作用，證明CRP可能是激活人肺血管平滑肌細胞中NF-κB信號，介導IL-6表達，提示肺動脈高壓過程中兩者之間存在關系[19]。本實驗中，肺動脈高壓大鼠IL-6和NF-κB的表達趨勢一致，也提示在肺動脈高壓中NF-κB可能調控IL-6的表達。低氧條件下小鼠巨噬細胞內NF-κB與IL-6的mRNA表達一致，進一步提示NF-κB可能參與肺高壓中巨噬細胞IL-6的表達調控。